李亞蘭，馮 園，楊雅娣，胡 意，譚 磊，鄧治邦，楊凌宸，王愛兵*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128；2.獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3.湘潭市中心醫(yī)院，湖南湘潭 411100)

近年來，越來越多的脊椎動物乳頭瘤病毒(Papilloma viruses,PVs)被發(fā)現(xiàn)和鑒定，該類病毒通過感染機體的鱗狀或粘膜上皮細胞導致亞臨床感染或良性增生，但某些病毒亞型或持續(xù)感染會導致人、牛、犬、貓家畜及野生動物(如野豬)等出現(xiàn)上皮增生性病變，而表現(xiàn)出各種臨床癥狀，甚至包括癌癥，如人類宮頸癌的發(fā)生與人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)、犬類鱗狀細胞癌與犬類乳頭瘤病毒(Canine papilloma virus,CPV)的感染密切相關。PVs不僅具有宿主特異性特點，而且基因型多，如已報道的HPV超過200個基因型、CPV有23個基因型[1]。

國外學者在1898年首次發(fā)現(xiàn)疣可在犬之間傳播，直到1959年才從無細胞提取物中獲得可傳播的CPV。不同類型的CPV感染犬類的不同部位(如口腔、皮膚、足部等)從而誘發(fā)不同的病理特征及臨床癥狀，包括皮膚乳頭瘤、口腔乳頭瘤、疣狀表皮增生、病毒色素斑、鱗狀細胞癌等[1]。受CPV感染的犬常會自發(fā)恢復，而且體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體可以保護它們不受再次感染，所以CPV感染通常不被認為是一種危及生命的疾病[2]，但最近有研究表明，CPV引起的良性乳頭瘤可惡性轉(zhuǎn)化為鱗狀細胞癌[3]，并且PVs感染對免疫功能低下的動物形成更大的威脅，比如在嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)犬內(nèi)生性乳頭瘤中發(fā)現(xiàn)的CPV2，其在免疫能力強的動物中沒有誘發(fā)乳頭瘤，同樣在實驗性接種的犬中也沒有引起類型特異性免疫反應[4]。該病毒感染后可影響犬的外貌、導致疼痛，在感染嚴重的情況下可造成犬的死亡，損害實驗犬飼養(yǎng)公司的經(jīng)濟效益，而且影響利用犬類進行科學實驗獲得相關數(shù)據(jù)的可靠性。此外，由于犬的自身狀況及周圍環(huán)境因素的影響，病毒也會隨新的宿主環(huán)境改變而進化，從而出現(xiàn)越來越多的突變體?；诖耍疚膶τ谠摬《镜纳飳W特征、流行情況、感染所致疾病及并發(fā)癥進行綜述，提高對該病毒及所致疾病的認識，為后期的基礎及臨床研究奠定理論基礎，同時提示需要對該病毒進行更進一步臨床及預防研究。

1 犬乳頭瘤病毒基本生物學特征

CPV為環(huán)狀、閉合、雙鏈DNA病毒，屬于乳頭瘤病毒科。病毒特征為無囊膜僅衣殼包裹的球形病毒粒子，呈典型對稱的二十面體，直徑約為40 nm～60 nm，其基因組大小約為7.7 kb～8.0 kb，是目前所知的PVs中基因組最大的病毒。CPV基因組編碼區(qū)含有7個～8個開放閱讀框(open-reading frames,ORF)，按照功能的不同主要分為3個部分：(1)早期轉(zhuǎn)錄E區(qū)(early-regions,ERs)：主要編碼非結(jié)構(gòu)的早期蛋白El、E2、E4、E5、E6、E7，參與病毒的復制與轉(zhuǎn)錄及基因的表達調(diào)控[5]。(2)編碼晚期蛋白L區(qū)(late-regions,LRs)：編碼結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2，其中L1為主要衣殼蛋白，有種屬、類型特異性和中和抗體抗原表位，可自組裝成類似病毒的VLPs，能誘導機體產(chǎn)生L1型特異性的中和抗體，具有較強的免疫原性；L2是次要衣殼蛋白，有種屬特異性抗原表位；兩者共同參與病毒的組裝與釋放[6-7]。(3)非編碼區(qū)(non-coding-regions,NCRs)：即長調(diào)控區(qū)(long-control-regions,LCRs)區(qū)，位于早期和晚期區(qū)之間，該區(qū)域不編碼任何蛋白，但調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄，是CPVs變異最多的區(qū)域[7]。

迄今為止，已鑒定出的23種CPVs類型分布于3個不同的屬中：Lambdapapillomavirus(CPV1、CPV6)；Taupapillomavirus(CPV2、CPV7、CPV13、CPV17、CPV19、CPV21、CPV22、CPV23)；Chipapillomavirus(CPV3、CPV4、CPV5、CPV8、CPV9、CPV10、CPV11、CPV12、CPV14、CPV15、CPV16、CPV18、CPV20)。每一種CPV類型都與特定的病變有關，如在Lambdapapillomavirus屬中，CPV1是最常見的類型，除可引起口腔乳頭瘤病，還與皮膚乳頭瘤和鱗狀細胞癌有關[8-9]。在Taupipillomavirus屬中，CPV2、7、13、17和19在內(nèi)生和外生乳頭瘤、口腔乳頭瘤病和鱗狀細胞癌中均有報道[13-16]。皮膚色素斑塊與Chipapillomavirus所有類型相關[9-12,17-20,]。

2 犬乳頭瘤病毒流行概況

由于犬乳頭瘤被認為是一種不危及生命的疾病，因此全球?qū)PV流行病學進行調(diào)查不多，相應的CPV流行病學數(shù)據(jù)及報道極少。CPV感染在大多數(shù)犬群中是地方性的[21]，所以需要在不同的國家進一步開展與CPV相關的流行病學調(diào)查，特別是在臨床表現(xiàn)和易感犬種方面。

現(xiàn)有的PVs流行病學調(diào)查顯示，并非所有的自然感染都會引起明顯的癥狀，而且病毒DNA可以在人類和一些動物(如犬)的臨床健康群體中檢測到。如一項研究報告表明有超過50%健康犬皮膚上可檢測到CPV-DNA的存在[22]，目前尚不清楚屬于亞臨床感染病例，或只是在其皮膚上攜帶CPV核酸。在研究中發(fā)現(xiàn)CPV1和CPV2是典型犬乳頭瘤的主要病毒，其中口腔以CPV1感染為主，其他部位以CPV2感染為主。盡管CPV具有多樣性，但也可能是共生的，尤其是CPV2感染的犬比例偏高，將可能會增加癌變的風險[1]。據(jù)文獻報道CPV在純種犬中的感染可能比混合品種更為普遍，同時，CPV引起疾病的發(fā)生率與狗的年齡和性別之間沒有統(tǒng)計學上的顯著相關性(P>0.05)[21]。但另一團隊在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，雄性犬患CPV的感染率(60%)高于雌性犬(40%)[23]。因此，在CPV感染流行病學的各方面研究尚需更大規(guī)模的調(diào)查分析?，F(xiàn)有犬乳頭瘤病零星報道總結(jié)如表1中。

表1 現(xiàn)有犬乳頭瘤病流行概況

3 犬病毒性乳頭瘤臨床癥狀

乳頭瘤是一種增生性上皮病變，通常發(fā)生于鱗狀上皮或粘膜上皮，許多是由PVs引起的，所以也被稱為病毒性乳頭瘤。CPV誘發(fā)的臨床癥狀具有如下特點：(1)CPV感染可能是亞臨床的，也可能引起微小病變或良性腫瘤；(2)受影響部位包括犬的陰莖、外陰、皮膚和結(jié)膜等[25]；(3)病毒性乳頭瘤可能是內(nèi)生的或外生的，典型地表現(xiàn)為病毒性細胞病變的形態(tài)學特征，包括發(fā)育異常、胞漿空泡化、細胞增生、肉芽腫、核內(nèi)包涵體、蘇木精和伊紅(HE)染色的藍灰色胞質(zhì)變性；(4)這些病變大多是暫時性的，但仍有一些持續(xù)存在并有可能逐漸發(fā)展為惡性鱗狀細胞癌，如人類和動物中有一部分HPV和動物PVs明顯與癌癥的發(fā)生有關，因此將這些PVs稱為高危型乳頭瘤病毒；(5)有數(shù)據(jù)表明CPV類型與病變類型及其進展之間存在一定的相關性[26]。

CPV誘發(fā)的臨床癥狀大致可以分為口腔乳頭瘤(Oral papillomatosis)、皮膚乳頭瘤(Cutaneous papillomas)、病毒色素斑(Viral pigmented plaques)、鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinomas)、疣狀表皮增生(Epidermodysplasia verruciformis)。在目前的23種CPV類型中，最常見的是Chipapillomavirus屬，它們都是從帶有色素斑塊的犬組織中分離出來的，其中一些新的突變株引起的癥狀會發(fā)展為鱗狀細胞癌[26-28]，具體的臨床癥狀如表2所示。

表2 CPV誘發(fā)的臨床癥狀

4 犬乳頭瘤病毒檢測方法

多種方法包括電鏡、原位雜交、滾環(huán)擴增、PCR、ELISA和NGS等，并結(jié)合臨床表現(xiàn)、流行病學、病理學觀察等用于檢測和確診犬CPV相關乳頭瘤病。這些方法各有所長，比如免疫組織化學需要相當數(shù)量的病毒蛋白來提供陽性信號從而清楚地顯示病毒的活性；原位雜交不僅可以確定病毒核酸在固定組織中的定位，從而確定感染的組織和細胞，還可靶向RNA時顯示病毒的轉(zhuǎn)錄；電子顯微鏡可實視化病毒特征性結(jié)構(gòu)，并證明生產(chǎn)性感染；滾環(huán)擴增法可用于新鮮但不固定的樣本(乳頭瘤病毒的環(huán)狀DNA未降解)，是一種獨立于序列而擴增整個病毒基因組的方法，有助于檢測和鑒定PVs。PCR及組織病理學常被用來對CPV進行分析和型別鑒定。下面簡要介紹幾種常用的CPV檢測方法：

4.1 聚合酶鏈反應

傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)通過對CPV-DNA中某一特定核苷酸序列進行擴增，然后通過凝膠電泳技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行定性分析。因此PCR引物設計尤為重要，目前有通用引物和特異引物，前者靶向CPV亞型L1-ORFs的保守序列，后者針對CPV各基因型E1基因保守序列的差異而設計[26]。

PCR檢測CPV步驟包括：(1)從疑似樣品中分離出犬基因組和病毒DNA；(2)利用犬GAPDH引物對進行PCR確認和分析核酸質(zhì)量；(3)利用靶向L1基因的簡并引物對進行PCR，擴增潛在的乳頭瘤病毒基因組片段；(4)利用特異性CPV亞型引物進行PCR確定所屬亞型；(5)確定亞型需要進行多次PCR，并且不能確定新的CPV類型或反饋假的結(jié)果，此情況下，可使用多引物滾環(huán)擴增(multiple-primed rolling-circle amplification,RCA)，然后將目的片段克隆再進行測序分析[32]。此外，在PCR過程中，采用較低的退火溫度，如50℃左右，可以擴增出范圍更廣的DNA模板[33]。因此，有必要設計更靈敏可靠的PCR引物，優(yōu)化反應條件。

4.2酶聯(lián)免疫吸附法

PVs在傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)中不易復制，而血清學檢測可基于異源表達的病毒抗原。PVs結(jié)構(gòu)蛋白L1的獨特性如可自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)及表現(xiàn)出的高度免疫原性，使得L1-VLP可用于疫苗接種和作為抗原進行血清學檢測[34]。研究表明，GST標記的L1蛋白同樣可以自發(fā)形成五聚體和VLP，并且這種表達技術(shù)的結(jié)果與桿狀病毒表達VLP的替代系統(tǒng)相同[27]。Lange C E等[29]將異源表達的CPV衣殼蛋白L1-N端與GST融合制備的蛋白作為抗原，建立了可同時鑒別兩種不同類型CPV抗體的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法，在檢測的血清中發(fā)現(xiàn)了針對COPV和CPV3的特異性抗體，也發(fā)現(xiàn)了大量對這兩種抗原都呈陽性的抗體。而未來需要產(chǎn)生和驗證其它基于CPV-L1的ELISA方法，以便用于CPV的檢測和研究。

4.3 免疫組化

研究人員對3種形式的犬SCCs(黏膜、皮膚和原位SCCs)樣本(通過PCR檢測含有PVs-DNA)進行了免疫組化(immunohistochemistry,IHC)分析，發(fā)現(xiàn)黏膜SCCs和皮膚SCCs在臨床上和組織學上相似，都表現(xiàn)為增生性、外生性和侵襲性，均有侵入真皮的非典型細胞索或島狀細胞組成，所有病例均有大核、核仁突出，并有大量核分裂，大多樣品中也存在過早的角化細胞。而原位SCCs在臨床中出現(xiàn)大量色素沉著、鱗狀斑、斑塊(伴有潰爛)和結(jié)節(jié)(潰瘍性結(jié)節(jié))；組織病理學上可見明顯的角化過度棘皮病和角膜結(jié)塊，表皮有大量不典型細胞和早期角化；異型性包括巨核細胞增多癥、不等核細胞增多癥、高色素、著絲過度、核仁突出、多核細胞和異常的有絲分裂，但基底膜完整，真皮未受影響[36-37]。

4.4 二代測序

二代測序(next generation sequencing techno-logy,NGS)技術(shù)的發(fā)展與進步，使得一次檢測中發(fā)現(xiàn)新的和多種病原體變得更加容易。例如Tarka等人[38]通過NGS調(diào)查了一家犬舍幼犬胃腸炎的可能感染原因種，發(fā)現(xiàn)犬星狀病毒是這些幼犬腹瀉的原因外，還檢測到其他病毒感染，包括一些CPV和一種犬細小病毒(疫苗株)以及一種非常低水平的彎曲桿菌。這項研究表明，NGS在獸醫(yī)診斷中既可以檢測共感染，也可以提供潛在有用的流行病學信息，以確定這些感染的可能來源。但是，高昂的成本使得NGS未能成為首檢CPV的有效手段。

5 犬乳頭瘤病毒疫苗研制情況

犬乳頭瘤病是一種以感染幼犬或免疫缺陷犬為主的自限性疾病。大多數(shù)病犬在不經(jīng)治療或干預的情況下會自行緩解，但病情嚴重時，手術(shù)無法徹底根除，不僅影響動物機體的正常功能，而且容易引起繼發(fā)感染和種群間傳播。目前預防和治療CPV感染的方法主要包括疫苗預防法、外科手術(shù)摘除法、中藥治療法等，均有一定的治療效果，但臨床創(chuàng)面容易受到飼養(yǎng)環(huán)境限制，引起繼發(fā)炎癥反應，造成預后不良，且多有復發(fā)[12]。因此，疾病主要以疫苗預防為主，同時加強飼養(yǎng)管理。

5.1 自體疫苗

自體疫苗，在疣病臨床治療中很常見，將被移除的疣制成一個粗制的疫苗，并注射到同一個動物體內(nèi)。據(jù)報道，該方法在治療犬乳頭瘤方面是有一定療效，用粗糙的疣提取液和佐劑，經(jīng)肌肉或皮下注射到犬體內(nèi)，2周～3周后，口腔黏被病毒感染時，阻止了疣的發(fā)展[39]。同樣使用滅活的粗疣提取物也對預防口腔乳頭瘤病具有效果，試驗研究顯示99只比格犬接種了經(jīng)福爾馬林滅活的COPV疣粗勻漿物，1個月后，接種疫苗的犬能夠?qū)Σ《靖腥酒鸬揭欢ǖ牡挚棺饔茫鴮φ战M不能抵抗病毒的入侵，都感染出現(xiàn)疣。隨后，超過6萬只比格犬接種了該疫苗，并沒有出現(xiàn)不良反應，但是，接種滅活的COPV提取物后，在注射部位偶爾會出現(xiàn)各種上皮性腫瘤，比如SCCs[39]。

5.2 COPV-L1-VLPs疫苗

重組CPV病毒衣殼蛋白L1在體外表達，并且能夠自組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，這使得新一代安全高效的COPV-L1-VLPs疫苗得以開發(fā)并可預防犬感染。在桿狀病毒表達系統(tǒng)中，體外表達的COPV主要衣殼蛋白L1形成VLPs，當注射到犬的足墊時，來自免疫犬的血清在被動轉(zhuǎn)移實驗中對實驗犬提供了完全保護[40]。并且發(fā)現(xiàn)這種免疫需要正確折疊顯示構(gòu)象表位的VLP，因為變性的L1蛋白產(chǎn)生的抗體則不能保護動物免受感染。Chen Y等人制備了突變型的COPV-L1-VLPs，該突變株雖然組裝成VLPs，但不表達中和構(gòu)象表位[41]。即使蛋白質(zhì)被截短，以消除中和構(gòu)象表位的表達，形成VLPs的能力仍然存在。形成VLPs的能力和表達重要構(gòu)象表位的能力之間的區(qū)別在疫苗設計中至關重要，這表明并非所有VLPs都具有預防作用。PVs衣殼表面的構(gòu)象依賴性抗原表位的鑒定對于了解病毒與宿主的早期相互作用以及開發(fā)有效的PVs疫苗具有重要意義。

5.3 GST-COPV-L1融合蛋白疫苗

目前臨床試驗中的預防性PVs疫苗是由病毒L1衣殼蛋白在真核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，并以VLPs的形式純化而成，但是表達效率低，為了評價VLPs是否可用于有效的疫苗接種，Yuan H[42]等人在大腸埃希氏菌中將L1蛋白表達為GST融合蛋白，發(fā)現(xiàn)GST-COPV-L1融合蛋白可形成五聚體。盡管這些衣殼樣結(jié)構(gòu)并沒有組裝成VLPs，但在先前驗證VLPs疫苗有效性的COPV模型中檢測到其免疫原性，并且動物實驗結(jié)果也顯示GST-COPV-L1五聚體完全保護犬免受高劑量病毒對其口腔黏膜的感染[42]。該研究表明雖然缺乏VLPs的形成，但GST-COPV-L1融合蛋白仍然保留其天然的構(gòu)象。總之，這是一種新的疫苗，可以保護犬免受CPVs感染。GST標記既不干擾顆粒組裝，也不干擾表位表達，GST-L1制劑作為疫苗具有保護作用。該疫苗基于GST-L1融合蛋白在細菌中的表達，為生產(chǎn)CPV疫苗提供了一種簡單、經(jīng)濟的替代方法，同時，可以作為第二代PVs疫苗的良好候選者。

5.4 COPV-L1-DNA疫苗

DNA可以通過針頭注射而在肌肉內(nèi)傳遞，也可以通過顆粒介導的DNA遞送(particle-mediated DNA delivery,PMDD)到表皮內(nèi)，每種途徑都能誘導細胞和體液免疫，但PMDD提供了強大的細胞和體液反應[43]。研究人員用低劑量的COPV-L1-DNA免疫比格犬，并通過PMDD方式將COPV-L1-DNA遞送到皮膚和口腔黏膜，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生適度的全身抗體和T細胞淋巴細胞增殖性免疫反應，從而完全保護比格犬免受高劑量傳染性COPV的攻擊[43]。DNA疫苗的操作相對簡單，也是預防高危型PV的有效策略，它能編碼多種抗原，在多價疫苗免疫中可以對抗多種PVs。同時，多核苷酸疫苗抗原的長期持續(xù)表達可使T細胞產(chǎn)生持久的反應，建立免疫記憶。

6 展望

CPV引發(fā)的犬乳頭瘤病是一種傳染性較強的疫病，其不僅對犬本身產(chǎn)生影響，而且對基于犬進行科學研究造成不良后果。隨著生活水平的提高和生活方式的改變，未來人們對于伴侶犬數(shù)量和質(zhì)量要求增加，因此有必要加強對于CPV的基礎研究和應用研發(fā)。首先，需針對當前國內(nèi)外CPV流行病學資料嚴重缺失的狀況，開展流行病學調(diào)查，從而對CPV流行程度做到心中有數(shù)。其次，CPV基因型的豐富性和高度的異質(zhì)性導致PVs的分子檢測一直是獸醫(yī)學的一個挑戰(zhàn)，在感染檢測方面除了改進現(xiàn)有的檢測技術(shù)之外，還需要取長補短，使不同檢測技術(shù)和不同學科之間的探索更加深入，將不同的檢測技術(shù)進行融合應用，研發(fā)更快速、靈敏和高特異性的新型檢測技術(shù)。再者，盡管在CPV預防疫苗方面進行了一些有益的嘗試，但仍未有任何一種商業(yè)化的疫苗產(chǎn)品面世。此外，除了研發(fā)預防性疫苗外，還需要研發(fā)治療性疫苗。雖然COPV-VLPs在動物預防接種中的作用已經(jīng)被證實，但全長COPV-L1蛋白對VLPs的形成不是必需的，通過用其他病毒蛋白替換L1蛋白的非必需區(qū)域來制造嵌合型VLPs顆粒從而具有多種抗原活性，而VLPs似乎能夠針對MHCⅠ和MHCⅡ抗原處理途徑的表位，表明利用這種技術(shù)開發(fā)治療性疫苗是可行的。最后，動物乳頭瘤病毒感染的預防性疫苗接種的成功，將為HPV感染疾病的預防策略提供很好的借鑒，因此，有效預防、治療性疫苗接種及其他治療方法的研制將是乳頭瘤病毒研究的重要目標。