牟 婧，金圣子，關(guān)桐旭，雷 磊，劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

奶牛產(chǎn)后敗血癥就是由于產(chǎn)后發(fā)生細(xì)菌感染，細(xì)菌入侵血液大量繁殖引起的全身性疾病。其多發(fā)于產(chǎn)后1周內(nèi)，發(fā)熱，精神沉郁，食欲減退，快速消瘦，瘤胃蠕動減弱，嚴(yán)重者會導(dǎo)致死亡。

大腸埃希氏菌在全球范圍內(nèi)都廣泛存在，可引起奶牛乳房炎、犢牛腹瀉、子宮內(nèi)膜炎等多系統(tǒng)疾病。大腸埃希氏菌在奶牛產(chǎn)后敗血癥中也十分多見，奶牛產(chǎn)后能量消耗巨大，抵抗力低，且很多奶牛在生產(chǎn)前就已存在慢性感染，加之產(chǎn)后體質(zhì)虛弱，極易導(dǎo)致炎癥擴(kuò)散，從慢性感染發(fā)展為危害生命的嚴(yán)重感染，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[1]。

沙雷氏菌是一種主要存在于土壤、水體中的一種條件致病菌，可引發(fā)魚類、昆蟲、奶牛等多種動物疾病[2]。在20世紀(jì)90年代初有外國學(xué)者系統(tǒng)統(tǒng)計了沙雷氏菌引起奶牛乳房炎的發(fā)病情況，其多與大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌混合感染，嚴(yán)重影響牛奶產(chǎn)量[3]。除奶牛本身存在沙雷氏菌感染外，在生產(chǎn)過程中，沒有對術(shù)野進(jìn)行徹底消毒，手術(shù)器械未經(jīng)徹底消毒，粗暴助產(chǎn)等等都容易引起細(xì)菌感染，再加上術(shù)后護(hù)理不到位，未能及時發(fā)現(xiàn)病情，由沙雷氏菌局部感染后擴(kuò)散引起的菌血癥也時有報道。

目前細(xì)菌耐藥已成為全球關(guān)注的衛(wèi)生安全問題，很多牛場依賴抗生素解決牛場中的動物疾病，但卻忽視了科學(xué)給藥，造成了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥情況，所以如何有效的治愈疾病但卻可以最大程度避免耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)成為牛場需要解決的難題，也成為關(guān)于細(xì)菌研究的熱點內(nèi)容，科學(xué)給藥，防止耐藥菌的產(chǎn)生，不僅關(guān)乎動物健康、牧場利益，更關(guān)乎公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全[4-5]。

本試驗根據(jù)某牛場出現(xiàn)奶牛產(chǎn)后嚴(yán)重感染，導(dǎo)致多頭母牛死亡，通過對病死牛剖檢采取相關(guān)病料進(jìn)行病原菌的分離與鑒定并對致病菌進(jìn)行藥敏試驗，對發(fā)病牛進(jìn)行疾病診斷及合理治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某牛場病死產(chǎn)后母牛，采取其肝臟、肺臟、心房、腸管、子宮肉阜等器官和乳汁。低溫保存送至實驗室檢驗。

1.1.2 實驗動物 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心購買5周齡昆明鼠55只。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、MHA培養(yǎng)基，博奧星公司產(chǎn)品；血瓊脂培養(yǎng)基，博賽公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化公司產(chǎn)品；DNA Marker、DNA聚合酶、dNTP，寶日醫(yī)公司產(chǎn)品；核酸染料Gel-red，蘭杰柯公司產(chǎn)品；微生物藥敏試紙，康泰公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD)，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；梯度PCR儀(C1000)，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；瓊脂糖水平電泳槽(DYCP-31DN)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床(THZ-300)，上海一恒科技儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱 (DRP-9162)，上海森信有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 觀察該牛場發(fā)病牛的臨床癥狀并進(jìn)行記錄；剖檢發(fā)病死亡的母牛，觀察內(nèi)臟病變，采取病料并進(jìn)行記錄。

1.2.2 病原的分離鑒定 將肝臟、肺臟、心房、腸管、子宮肉阜的樣品取其切面或內(nèi)容物涂布到麥康凱瓊脂、血瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂上，逐步進(jìn)行畫線分離培養(yǎng)，同時進(jìn)行革蘭氏染色。

將純化的菌株的培養(yǎng)液送至吉林庫美生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測序，測序結(jié)果NCBI進(jìn)行blast同源性比較。

1.2.3 毒力基因檢測 用PCR檢測分離出的大腸埃希氏菌黏附素(K88、K99、F17、F41、bfpA、CS31A)、毒素(STa、STb、Stx1、Stx2、hlyA)及毒力島(eaeA、Irp2)共13種基因的檢測。

1.2.3.1 DNA模板的制備 取各分離株1 mL菌液，用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行分離株DNA的提取，將提取到的DNA保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3.2 毒力基因引物的設(shè)計與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]中提供的各個毒力基因的序列設(shè)計引物，送至吉林庫美生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。引物相關(guān)信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增毒力基因 以制備好的分離株DNA為模板，配置PCR擴(kuò)增體系25 μL進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR完成后，以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍照檢查。

1.2.4 牛場飲用水水質(zhì)檢測 將送檢的7個樣品，在超凈臺中每個樣品各取100 μL分別接種于NB培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻。37℃恒溫培養(yǎng)18 h，分別進(jìn)行總菌落數(shù)計數(shù)和大腸埃希氏菌菌落計數(shù)。

1.2.5 大腸埃希氏菌同源性檢測

1.2.5.1 同源性檢測引物的設(shè)計與合成 設(shè)計1對用于大腸埃希氏菌同源性檢測的隨機(jī)引物(5′-GAACGCTGCC-3′)，送至吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.2.5.2 PCR擴(kuò)增檢測同源性 根據(jù)1.2.3.1的方法提取病料和飲用水中分離出的大腸埃希氏菌分離株的DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍照檢查。

1.2.6 分離菌株的致病性試驗 取55只6周齡的昆明鼠，每組5只，將其隨機(jī)分為11個組，10個組為試驗組，1個組為對照組。對試驗組昆明鼠每組腹腔注射菌懸液0.2 mL(5×109CFU/mL)，對照組腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水，觀察1周內(nèi)小鼠的發(fā)病及死亡情況，進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.7 藥敏試驗 將各分離株用生理鹽水校正至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?，用無菌棉拭子蘸取菌液均勻地涂抹在Mueller-Hinton瓊脂平板的整個表面。針對12種藥物進(jìn)行藥敏試驗。貼有藥敏片的Mueller-Hinton瓊脂平板于37℃、靜置培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和ATCC25923為對照，根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察及剖檢

先后將4頭產(chǎn)后2 d至20 d的病死牛進(jìn)行剖檢，死前全身消瘦，脫水，發(fā)熱，呼吸困難，病死牛心、肝、肺、腸管、子宮均出現(xiàn)不同程度的出血壞死，胸壁黏連，部分病死牛肝肺呈綠色，腸道臌脹，有血樣乳汁。

2.2 病原菌的分離

病料經(jīng)多次劃線分離培養(yǎng)，分離出8株在麥康凱上形成中等大小的粉紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上顯示出金屬光澤的菌落。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可見其為形狀短粗的革蘭氏陰性桿菌。經(jīng)16S rRNA測序，鑒定出以上8株菌均為大腸埃希氏菌。在其中1頭病死牛的乳樣中，分離出1株細(xì)菌，其在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小的粉紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成透明菌落，無金屬光澤，在血瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶血環(huán)，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可見其為革蘭氏陰性桿菌。經(jīng)16S rRNA測序，鑒定出此菌為沙雷氏菌。在其中另1頭病死牛的乳汁樣品中。分離出1株在血瓊脂平板上有溶血環(huán)的細(xì)菌，革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)是呈葡萄串狀的陽性球菌，經(jīng)16S rRNA菌種鑒定為產(chǎn)色葡萄球菌。

2.3 大腸埃希氏菌毒力基因的檢測

在8株大腸埃希氏菌中，有1株檢出hlyA(圖1)和STb(圖3)兩種毒力基因；另有2株均檢出毒力基因F17(圖2)，其他毒力基因檢測結(jié)果均為陰性。9號為陽性對照。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2 000；1～8.分離株1～8；9.陽性對照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2 000； 1～8.分離株1～8； 9.陽性對照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2 000； 1～8.分離株1～8；9.陽性對照

2.4 牧場水質(zhì)檢測

總菌數(shù)檢測結(jié)果表明，7個送檢水樣的菌落數(shù)均遠(yuǎn)大于300個，多至不可計數(shù)，根據(jù)我國《生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)中規(guī)定飲用水菌落總數(shù)不得大于100 CFU/mL，此總菌落數(shù)檢測結(jié)果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于國家標(biāo)準(zhǔn)限量。大腸埃希氏菌數(shù)檢測結(jié)果表明，7個水樣大腸埃希氏菌菌落數(shù)分別為700 CFU/mL、60 CFU/mL、210 CFU/mL、10 CFU/mL、780 CFU/mL、60 CFU/mL、90 CFU/mL。根據(jù)我國生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB5749-2006)中規(guī)定飲用水大腸埃希氏菌數(shù)為每100 mL不得檢出。故可看出，該牧場牛的飲用水中大腸埃希氏菌數(shù)量也嚴(yán)重超標(biāo)。

2.5 大腸埃希氏菌同源性檢測

病料中分出的8株大腸埃希氏菌均有較高同源性，其中2、3同源性比對結(jié)果基本一致，4、5、6同源性結(jié)果相似度也很高(圖4)。飲用水中分離出的疑似大腸埃希氏菌的菌株與病料中分離出的大腸埃希氏菌均不具有同源性，且飲用水中分離出的12株菌之間有較低同源性(圖4)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1～8.分離株1～8；a～l.來自飲用水中的分離株 a～lM.DNA Marker DL2000;1-8.Isolates 1-8;a-l.Isolates in drinking water a-l

2.6 致病性檢驗

接種大腸埃希氏菌的小鼠共8組，每組5只。第1組12 h內(nèi)有2只死亡，72 h內(nèi)又有1只死亡，其余存活下來的小鼠被毛凌亂，精神萎靡；第2、3組在12 h內(nèi)有2只死亡，24 h內(nèi)又有1只死亡；第6組在72 h內(nèi)有1只死亡；以上4組死亡的小鼠，均不同程度的出現(xiàn)腹瀉、眼部分泌物增多的癥狀。第4、5、7、8組沒有小鼠死亡，但大部分小鼠被毛凌亂，不思飲食，96 h之后小鼠基本恢復(fù)正常。剖檢病死小鼠，可觀察到心臟、肺臟、胃腸道出血。接種沙雷氏菌的小鼠有1組，共5只。在24 h內(nèi)有3只小鼠死亡，其余小鼠被毛凌亂、閉眼、活動力下降。接種產(chǎn)色葡萄球菌的小鼠有1組，共5只。在12 h內(nèi)有2只小鼠死亡。

2.7 藥敏試驗結(jié)果

本試驗用14種藥物對分離出的8株大腸埃希氏菌，1株沙雷氏菌，1株產(chǎn)色葡萄球菌進(jìn)行了藥敏試驗。試驗結(jié)果見表2和表3。

表2 大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果

表3 沙雷氏菌和產(chǎn)色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

本次牧場出現(xiàn)的母牛產(chǎn)后敗血癥，經(jīng)臨床診斷和實驗室診斷，判斷其因為產(chǎn)前本就存在大腸埃希氏菌、沙雷氏菌、產(chǎn)色葡萄球菌中的一種或幾種導(dǎo)致的乳房炎，且在生產(chǎn)過程中沒有嚴(yán)格消毒，造成母牛子宮發(fā)生感染，加上產(chǎn)后母牛免疫力下降，局部炎癥迅速擴(kuò)散，導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性感染，且發(fā)現(xiàn)不及時，病情發(fā)展迅速，未能來得及給出及時有效的治療方案，最終導(dǎo)致母牛因感染死亡。

在實驗室檢查中，共分離出8株大腸埃希氏菌、1株沙雷氏菌和1株產(chǎn)色葡萄球菌。在8株大腸埃希氏菌中，有1株檢出hlyA和STb兩種毒力基因；另有2株均檢出毒力基因F17，且都具有相較于其他菌株較強(qiáng)的致病力。盡管大腸埃希氏菌并非乳腺的正常菌群，但由于大腸埃希氏菌廣泛地存在于牛的生活環(huán)境中，很多牛場還是存在乳腺炎的慢性感染。在剖檢牛的過程中發(fā)現(xiàn)部分牛有乳汁中帶血的癥狀，而細(xì)菌從機(jī)體的其他部分通過血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到乳房進(jìn)行感染是極為少見的[8]，故排除此種情況，我們認(rèn)為是乳房本就存在細(xì)菌感染，而后由于產(chǎn)后免疫力降低而發(fā)生擴(kuò)散。關(guān)于奶牛的乳腺炎，已有豐富的研究資料可以證明，乳腺感染易發(fā)于奶牛干乳期的后2周和產(chǎn)犢前的2周時間內(nèi)[9]，所以我們建議牧場，在此期間一定注意奶牛的健康狀態(tài)，提供更加干凈的生存環(huán)境。

除了剖檢過程中發(fā)現(xiàn)子宮出現(xiàn)感染壞死外，牧場的其他同期生產(chǎn)的母牛中也有發(fā)現(xiàn)子宮感染的癥狀，推斷可能在生產(chǎn)過程中，存在手術(shù)器械消毒不徹底，生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生較差或暴力助產(chǎn)的情況。這種情況在實際生產(chǎn)的過程中常見，有國外學(xué)者對奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)子宮感染的病例做了統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：有36%～50%的動物在產(chǎn)后發(fā)生明顯子宮感染的癥狀，Benzaquen M E的研究表明有18.5%和21%的動物有典型的全身感染的癥狀，還有很多產(chǎn)后感染處于亞臨床狀態(tài)，并未引起人們的察覺，但其危害同樣不可小覷[10]。

在藥敏試驗方面，我們通過K-B法進(jìn)行篩選，最終選擇了慶大霉素和美羅培南用于該場的治療。通過藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該場的大腸埃希氏菌存在較為嚴(yán)重的耐藥情況。2019年，Hutchings M I的報道中也提到細(xì)菌耐藥的問題。截止至2018年12月，在美國有45種抗生素正在進(jìn)行臨床階段的研究，但針對廣泛耐藥的革蘭氏陰性菌，目前新抗生素的研發(fā)依然是杯水車薪[11]。我國牧場的情況也是如此，由于耐藥菌的不斷產(chǎn)生，抗生素的選擇余地越來越小，我們只有努力控制好牧場的病情，少發(fā)病少用藥，對于已經(jīng)患病的動物合理科學(xué)給藥，在能在最大程度上減慢耐藥菌的產(chǎn)生進(jìn)程。

另外，牧場水質(zhì)在細(xì)菌總數(shù)和大腸埃希氏菌數(shù)兩方面嚴(yán)重超標(biāo)，雖然沒能在飲用水中找到使奶牛患病的致病菌，但奶牛生存環(huán)境細(xì)菌密布，這將對動物的安全產(chǎn)生各方面的威脅，有國外學(xué)者進(jìn)行了擠奶用毛巾上的細(xì)菌數(shù)量與奶牛乳房炎的相關(guān)研究[12]，近年來也有不少關(guān)于水質(zhì)、土壤以及飼養(yǎng)人員對耐藥菌產(chǎn)生的影響。這也說明了動物的生存環(huán)境對于保持健康以及減少耐藥菌的產(chǎn)生十分重要[13]。

從此次發(fā)病牧場的情況來看，牧場動物健康的管理，不能依賴于疫苗和藥物，要更多地從改善動物生存環(huán)境出發(fā)，從根源上減少患病的可能，這才是形成良好的牧場環(huán)境，延緩耐藥菌形成，維持動物健康和獲得良好經(jīng)濟(jì)效益的根本之策。