馬紅櫻，黃炳輝，劉 程，袁應(yīng)旺

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,湖北 黃石 435003)

發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia,PKD)是最常見的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，在兒童期或青春早期發(fā)病，平均發(fā)病年齡為12歲。其臨床癥狀為反復(fù)的簡(jiǎn)短的肌張力障礙性發(fā)作、手指徐動(dòng)癥、投擲樣動(dòng)作、舞蹈樣運(yùn)動(dòng)或幾種癥狀的結(jié)合[1-2]。良性家族性嬰兒驚厥(Benign Familial Infantile Seizures,BFIS)是一種癲癇綜合征，常在0.5～2歲發(fā)病[3]。PKD和BFIS常共存于同一個(gè)家系，或同一個(gè)患者的不同發(fā)育時(shí)期[4]。

PKD 的發(fā)病因素主要是遺傳因素，即為原發(fā)性PKD，有家族史的PKD患者約占60%，而散發(fā)患者約占40%。PKD為常染色體顯性伴不完全顯性的方式遺傳。大量研究報(bào)道，PKD/BFIS最常見的致病基因是PRRT2(Proline-Rich Transmembrane Protein 2;OMIM*614386)[5-7]。中國PKD家系及韓國、日本和歐洲的PKD家系的致病基因也主要是PRRT2基因，占家族性PKD致病基因的80%～90%。同時(shí)，33%～46%的散發(fā)性PKD患者中也檢測(cè)到PRRT2突變[8]，其中突變c.649dupC (p.R217PfsX8)是PRRT2 基因的熱點(diǎn)突變，約占總突變的93.75%[9]。該突變?cè)诓煌朔N之間的分布頻率沒有差異，散發(fā)性PKD患者中新發(fā)突變也占一定的比例。

由于PKD具有短暫性、發(fā)作性的特點(diǎn)，臨床診斷中經(jīng)常被誤診為癲癇，因此，在臨床診斷中對(duì)PKD致病基因的鑒定有利于提高診斷率，防止誤診[10]。本研究將從散發(fā)性和家族性PKD病例中鑒定PRRT2基因突變，旨在為PKD的臨床診斷提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 儀器和試劑

1)儀器。PCR儀(美國ABI life2720)；超微量紫外分光光度儀(Thermo Nan-odrop 2000c)。

2)試劑。PCR試劑(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司)；DNA提取試劑盒(Promega公司)；電泳試劑實(shí)驗(yàn)室自配：瓊脂糖(Agarose,產(chǎn)品編號(hào):10208ES60，產(chǎn)地：YEASEN)，1×TAE緩沖溶液， 6×loading 緩沖溶液，溴化乙錠(10 mg/mL)。

1.2 病例收集

本研究收集了13個(gè)散發(fā)性PKD患者，其中3例患者在2歲之前表現(xiàn)為BFIS，即BFIS合并PKD，其余10例為PKD表型的患者。另外，本研究還收集到1個(gè)三代PKD家系，符合常染色體顯性遺傳模式，先證者9歲發(fā)病，以反復(fù)的投擲樣、舞蹈樣肌陣攣發(fā)作為。PKD患者臨床特征及PRRT2基因突變分析結(jié)果見表1。研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并通過了黃石市中心醫(yī)院的倫理學(xué)委員會(huì)審核和批準(zhǔn)?；颊呋蚧颊弑O(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書。

表1 PKD患者臨床特征及PRRT2基因突變分析結(jié)果

1.3 外周血采集、DNA提取及濃度和純度測(cè)定

簽訂知情同意書后，用EDTA抗凝管采集血樣5 mL，參考Promega公司DNA提取試劑盒內(nèi)操作步驟進(jìn)行提取[11]。通過超微量紫外分光光度儀測(cè)到DNA濃度為400～1 000 ng/μL，純度(A260/A280)為1.83～1.87，PKD患者/家系成員外周血基因組DNA濃度和純度見表2。

表2 PKD患者/家系成員外周血基因組DNA濃度和純度

1.4 PRRT2基因的引物設(shè)計(jì)

通過Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)查詢基因序列，發(fā)現(xiàn)一共有4個(gè)外顯子(exons)(轉(zhuǎn)錄本ID：ENST00000358758.12)，編碼序列從第2個(gè)外顯子開始，而且第2個(gè)外顯子序列較長(zhǎng)，設(shè)計(jì)2對(duì)擴(kuò)增引物，第3、第4個(gè)外顯子序列較短，共設(shè)計(jì)1對(duì)引物，因此只需設(shè)計(jì)3對(duì)引物就可以完成對(duì)3個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列的測(cè)序驗(yàn)證，用于Sanger測(cè)序進(jìn)行PRRT2基因突變分析的引物序列見表3。引物設(shè)計(jì)原則及注意事項(xiàng)參見《分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，使用Oligo 7進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)設(shè)計(jì)好的引物通過e-PCR(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/epcr/)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)引物的特異性及可行性。引物的合成訂購自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司。

表3 用于Sanger測(cè)序進(jìn)行PRRT2基因突變分析的引物序列

1.5 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的條帶

以患者DNA為模板，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為標(biāo)準(zhǔn)的40 μL反應(yīng)體系，詳見2×Taq PCR Mix說明書。PCR反應(yīng)條件為常規(guī)反應(yīng)條件，不同引物的退火溫度見表3，產(chǎn)物延長(zhǎng)的時(shí)間為1 000 bp/min。

1.6 PCR產(chǎn)物的突變分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后，送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

PRRT2是鑒定到的PKD和BFIS的第1個(gè)致病基因，也是主要的致病基因[5-7]。在13個(gè)散發(fā)性PKD患者中鑒定到5個(gè)PRRT2突變，其中4個(gè)突變文獻(xiàn)已報(bào)道和PKD表型相關(guān)聯(lián)。在1號(hào)和12號(hào)散發(fā)性PKD/BFIS患者中鑒定到的PRRT2基因的重復(fù)突變c.621dupA/p.Ser208Ilefs*17和c.649dupC/p.Arg217Profs*8分別如圖1和圖2所示，這2個(gè)重復(fù)突變導(dǎo)致密碼子序列發(fā)生位移，產(chǎn)生相同氨基酸序列的截短蛋白，因此也屬于移碼突變[12]。

圖1 在1號(hào)散發(fā)性PKD/BFIS患者中鑒定到的PRRT2基因的重復(fù)突變c.621dupA/p.Ser208Ilefs*17

圖2 在12號(hào)散發(fā)性PKD/BFIS患者中鑒定到的PRRT2基因的重復(fù)突變c.649dupC/p.Arg217Profs*8

文獻(xiàn)報(bào)道，超過90%的攜帶PRRT2突變的患者有c.649dupC突變，而且該突變也導(dǎo)致熱性驚厥(Febrile Seizures,FS)、BFIS和無熱性部分發(fā)作(afebrile focal seizures)等癲癇表型，因此，它是PRRT2基因的突變熱點(diǎn)[9]。c.621dupA目前只在1個(gè)PKD合并BFIS的中國家系中鑒定到[13]。在3號(hào)和6號(hào)散發(fā)性PKD患者中鑒定到的PRRT2基因的錯(cuò)義突變c.796C>T/p.Arg266Trp和c.913G>A/p.Gly305Arg分別如圖3和圖4所示，其中c.796C>T/p.Arg266Trp是純合突變，c.913G>A/p.Gly305Arg是雜合突變，這2個(gè)突變已見報(bào)道和PKD相關(guān)聯(lián)[11]，而且Labate等[14]研究發(fā)現(xiàn)PRRT2純合突變的表型比較嚴(yán)重，包括精神發(fā)育遲滯、共濟(jì)失調(diào)、智力障礙、癲癇。

圖3 在3號(hào)散發(fā)性PKD患者中鑒定到的PRRT2基因的錯(cuò)義突變c.796C>T/p.Arg266Trp

圖4 在6號(hào)散發(fā)性PKD患者中鑒定到的PRRT2基因的錯(cuò)義突變c.913G>A/p.Gly305Arg

在10號(hào)散發(fā)性PKD/BFIS患者中鑒定到的PRRT2基因的雜合錯(cuò)義突變c.430C>G/p.Pro144Ala如圖5所示，該突變?cè)贓xAc(外顯子組整合數(shù)據(jù)庫)和1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫中記錄為SNP(rs150501365)，最小等位基因頻率MAF值小于0.01，該突變目前沒有見報(bào)道。

圖5 在10號(hào)散發(fā)性PKD/BFIS患者中鑒定到的PRRT2基因的雜合錯(cuò)義突變c.430C>G/p.Pro144Ala

另外，在1個(gè)家族性PKD家系中鑒定到的1個(gè)新的PRRT2插入突變c.984insATC如圖6所示。

圖6 在1個(gè)家族性PKD家系中鑒定到的1個(gè)新的PRRT2插入突變c.984insATC

PRRT2的插入突變c.984insATC突變導(dǎo)致PRRT2蛋白的C端跨膜結(jié)構(gòu)域在第329位增加一個(gè)異亮氨酸，即p.Ile329_Ala330insIle，該突變?cè)贓xAc或1000 Genomes Project數(shù)據(jù)庫中都沒有記錄。因此，新鑒定到的2個(gè)突變c.430C>G和c.984insATC與表型的關(guān)系還需進(jìn)一步功能驗(yàn)證。

3 結(jié)論

通過Sanger測(cè)序在13例散發(fā)性PKD病例中鑒定到5個(gè)PRRT2突變，其中包括2個(gè)重復(fù)突變和3個(gè)錯(cuò)義突變，包括熱點(diǎn)突變c.649dupC。突變檢測(cè)率為38.5%，和文獻(xiàn)報(bào)道的33%～46%的散發(fā)性PKD患者檢測(cè)到PRRT2突變的結(jié)果相一致[8]。另外，在一個(gè)家族性PKD家系中鑒定到一個(gè)PRRT2基因的新發(fā)突變c.984insATC。由于PKD具有短暫性、發(fā)作性和癲癇發(fā)作相似等特點(diǎn)，臨床診斷中經(jīng)常被誤診為癲癇[1]。因此，對(duì)家族性或散發(fā)性PKD患者進(jìn)行PRRT2基因的突變分析有很重要的臨床診斷意義。