周文旭，佘君，梁熹，張玉磊，趙穎丹

（西安交通大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，陜西 西安 710049）

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一類全身性疾病，以滑膜炎癥和關(guān)節(jié)的進行性破壞為特征[1,2]。盡可能延遲和緩解RA對骨關(guān)節(jié)功能造成的損害是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的目的[3]。在RA活動期，滑膜組織及血管翳組織過度增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨，從而直接破壞關(guān)節(jié)周圍的骨組織，因此誘導(dǎo)滑膜組織的細(xì)胞凋亡及抑制炎性滑膜組織增生成為RA治療的研究熱點[4,5]。

雷公藤具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎止痛等作用，治療RA效果確切，但目前尚不明確具體的作用機制。本文擬建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型(adjuvant arthritis，AA)，研究雷公藤對滑膜組織Bax、caspase-3、caspase-9及Bcl-2蛋白表達的影響，探討雷公藤治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡清潔級Wistar大鼠，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制品研究所。

1.2 藥品與試劑

弗氏不完全佐劑與酸可溶性II型膠原蛋白（CII)購自Sigma公司，雷公藤片為華潤三九（黃石）藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG、Bcl-2、Bax、Caspase-9、 Caspase-3和GAPDH抗體及為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。熒光定量試劑為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Thermo公司產(chǎn)品；Trizol購自invitriogen公司提供；引物由invitriogen公司合成。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組

選取體重50g-100g的清潔級Wistar大鼠40只，用0.lmmol/L醋酸溶解II型膠原蛋白，濃度為2mg/mL，然后4℃過夜，再混合等量的弗氏完全佐劑，充分乳化在冰浴中。實驗組每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2mg。造模后l0日，大鼠隨機分為5組，分別為高、中、低給藥組、模型組、假模型組，每組各8只。每組給藥量如下：高給藥組：50mg/kg，中給藥組：10 mg/kg，低給藥組：1mg/kg，按10mL/kg劑量每日1次灌胃，模型組、假模型組給予每日1次的1.0g/kg等量生理鹽水灌胃。各組給藥頻次按照臨床用藥規(guī)格給藥，用藥30d。用毛細(xì)管放大測量法在致炎后第14, 16, 18, 20, 24, 28日測右后足體積，求腫脹增長百分率[(給藥后值-給藥前值)/給藥前值]×100%。在造模前、造模后每周測 1次體重，每天觀察大鼠的神志及活動狀態(tài)、體毛的色澤改變、全身遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、局部炎癥紅腫等。

1.3.2 分離培養(yǎng)滑膜細(xì)胞

大鼠末次給藥后24h，無菌操作取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪成1 mm3大小后加4 m10.4mg/mL的II型膠原酶溶于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，孵育3h（5% CO2條件下），離心收集未貼壁的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素、15%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素），在5%CO2體積分?jǐn)?shù)，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2～4代細(xì)胞用于實驗。用DMEM培養(yǎng)液（含15%小牛血清）將滑膜細(xì)胞數(shù)調(diào)整至每毫升1×106個細(xì)胞，每孔2mL，加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，在5%CO2體積分?jǐn)?shù)，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。

1.3.3 凋亡蛋白mRNA表達水平測定

按試劑盒說明書進行滑膜細(xì)胞總RNA抽提。按試劑盒一步法步驟，采用半定量RT-PCR法進行，引物序列具體見表1。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Doe Gel 1000成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照并進行吸收度積分值分析，目的基因mRNA的相對含量為目的基因 PCR產(chǎn)物吸收度積分值比內(nèi)參照GAPDH PCR產(chǎn)物的吸收度積分值，重復(fù)3次實驗。

表1 線粒體凋亡途徑凋亡蛋白qRT-PCR引物序列及相應(yīng)產(chǎn)物大小

1.3.4 凋亡蛋白表達測定

提取細(xì)胞總蛋白后取50μg蛋白質(zhì)樣品，加上樣緩沖液煮沸變性，進行10%SDS PAGE；電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用TBS(含5%脫脂奶粉，pH 8.0)封閉2h；分別加入適量Caspase-3兔多抗IgG(1:400)、Bax鼠單抗IgG (1:400)、Bc1-2、室溫下在搖床上反應(yīng)2h；每次20min洗膜，3次后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1:6000)，室溫反應(yīng)2h；洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光及X光顯影。掃描儀掃描圖像后，用 Band Scan 5.0進行吸收度積分值分析，目的蛋白表達量的相對含量為目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH蛋白表達量的吸收度積分值之比，重復(fù)3次實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備

和正常組相比，致炎組大鼠精神萎靡，毛色晦暗并輕微脫毛，體重增長緩慢，食量減少，雙側(cè)后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，尾部出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，說明造模成功，模型成功率達90.6%。模型組在致炎14d后大鼠右后足開始腫脹，腫脹度達峰值在致炎后28d左右。相比模型組，雷公藤抑制大鼠足腫脹有劑量依賴性，且模型組的足越腫脹，其抑制作用越強，在致炎后18d前后雷公藤抑制作用達峰值，見圖1。其中，我們選擇中劑量給藥組進行下面的實驗。

圖1 雷公藤抑制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠大鼠足腫脹的作用

2.2 對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中凋亡蛋白mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果(圖2)顯示，與模型組相比較，中劑量給藥組Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表達均上調(diào)（P＜0.01）,而Bcl-2 mRNA表達則明顯下調(diào)(P＜0.01)。

圖2 線粒體Caspase-3、Caspase-9、Bax、 Bcl-2mRNA表達水平

2.3 對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中凋亡蛋白表達的影響

結(jié)果表明(圖3)，與模型組相比，中劑量給藥組的Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)；Bc1-2蛋白表達量下降 (P＜0.01)。

圖3 線粒體Caspase-3、Caspase-9、Bax、 Bcl-2表達水平

3 討論

抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物試驗中，廣泛應(yīng)用II型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型。在本試驗中，與模型組相比，雷公藤顯示劑量依賴性抑制CIA大鼠足腫脹，(P＜0.01)，說明其對CIA大鼠的足腫脹有顯著抑制作用。

造成關(guān)節(jié)損害的主要病理基礎(chǔ)是RA滑膜過度增生、增厚。1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡的概念后，細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域己成為自身免疫疾病的熱點之一。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡在RA的發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡數(shù)是相對減少，即滑膜組織中細(xì)胞增殖數(shù)和細(xì)胞凋亡數(shù)均呈增加趨勢，但前者增加遠遠高于后者，從而導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生過度[6,7]。說明RA發(fā)病不僅僅是由于其滑膜細(xì)胞增生調(diào)控一方面的事情，其滑膜細(xì)胞的過度增生與其凋亡機制障礙密切相關(guān)。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。這些基因有Bcl-2家族、caspase家族、C-myc、P53等。

我國用中草藥治療風(fēng)濕病的歷史己有上千年，通過誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡，許多藥物如甲氨喋吟、青風(fēng)藤等均可抑制關(guān)節(jié)免疫炎癥[8]。雷公藤臨床應(yīng)用于治療風(fēng)濕性疾病歷史悠久，取得了很好的療效，但其藥理機制尚不明確，對其抗風(fēng)濕的藥理機制研究特別是其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎凋亡方面作用的研究還存在著許多空白，因此，研究其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎凋亡的影響是一項新的方向。

在本研究中發(fā)現(xiàn)雷公藤能明顯減輕CIA大鼠足腫脹度，改善大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀。進一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜細(xì)胞的Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達下降，而Bcl-2表達增加，顯示細(xì)胞增生與細(xì)胞凋亡不平衡，滑膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達異常從而導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生。本研究中雷公藤使大鼠滑膜細(xì)胞Bax、Caspase-9、Caspase-3表達明顯升高，Bc1-2表達減少，說明雷公藤通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)caspase-9、caspase-3活化，促進滑膜細(xì)胞的凋亡，抑制滑膜細(xì)胞的增殖，發(fā)揮其治療RA關(guān)節(jié)炎的作用。