王夢薇 張迪 陸瑞敏 王文雅 張雪麗 陳萌

心絞痛(angina pectoris)主要是由冠狀動脈痙攣或阻塞、心肌暫時缺血或缺氧所引起的心血管疾病，相當(dāng)于中醫(yī)的“胸痹”，是臨床多發(fā)疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢[1]。心絞痛如果得不到有效的緩解和治療，隨時可出現(xiàn)心律失常、心肌梗死或心力衰竭等惡性并發(fā)癥。西藥治療心絞痛存在耐受性差、耐藥性強(qiáng)、不良反應(yīng)重等問題，中醫(yī)藥在治療心絞痛方面具有特有優(yōu)勢[2]。枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯[3-4]治療心絞痛在臨床上已被廣泛使用，并取得了顯著的療效。

《金匱要略》云：“胸痹心中痞，留氣結(jié)在胸，胸滿，脅下逆搶心，枳實(shí)薤白桂枝湯主之；人參湯亦主之。”歷代醫(yī)家對枳實(shí)薤白桂枝湯與人參湯皆主胸痹的認(rèn)識眾說紛紜。一部分學(xué)者認(rèn)為，兩復(fù)方適用于胸痹病的不同階段，枳實(shí)薤白桂枝湯應(yīng)用于急性期，而人參湯則應(yīng)用于緩解期；一部分學(xué)者認(rèn)為該條所述的胸痹病分為虛實(shí)二證，偏于實(shí)者用枳實(shí)薤白桂枝湯，偏于虛者用人參湯；也有學(xué)者認(rèn)為兩方皆主胸痹是為體現(xiàn)仲景“心胃同治”的思想[5]。目前，針對兩方治療胸痹的對比研究多停留在理論或臨床研究，其藥物活性成分以及作用機(jī)制的研究相對較少，值得進(jìn)一步深究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“多成分—多靶點(diǎn)—多途徑”綜合調(diào)控的中藥機(jī)理研究方法，能夠系統(tǒng)的反映藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制，從整體探索中藥和機(jī)體的作用關(guān)系[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)及相關(guān)活性成分，通過分析兩復(fù)方治療心絞痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)、蛋白以及相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯中藥物活性成分的篩選與收集

枳實(shí)薤白桂枝湯由枳實(shí)、厚樸、薤白、桂枝、栝蔞實(shí)5味藥組成，人參湯由人參、甘草、干姜、白術(shù)4味藥組成。將上述9味藥分別輸入TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)[7]和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)檢索并收集所有單位藥物的活性成分。借助TCMSP平臺的ADME參數(shù)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選單位藥物的活性成分。

1.2 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯中藥物潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測

應(yīng)用TCMSP分析平臺，在線搜索枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯單味藥物活性成分的靶點(diǎn)信息，應(yīng)用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索已篩選活性成分的靶點(diǎn)，限定物種為人，剔除沒有靶點(diǎn)或靶點(diǎn)信息不明確的化合物。使用UniProt(http://www.uniprot.org)進(jìn)行靶點(diǎn)—基因名轉(zhuǎn)換，將檢索得到基因名校正為官方名稱(official symbol)。

1.3 心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)篩選

預(yù)測疾病靶點(diǎn)的信息參考6個疾病數(shù)據(jù)庫：HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(http://omim.org/)[8]、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[9]、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)[10]、DisGeNET(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、HPO(https://hpo.jax.org/app/)，以“Angina Pectoris”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，分析對比后，歸納整理對心絞痛有明確作用的基因。

1.4 活性成分—藥物靶點(diǎn)、活性成分—疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

根據(jù)上述篩選以及預(yù)測結(jié)果，將兩復(fù)方的活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)基因與心絞痛相關(guān)的靶標(biāo)基因進(jìn)行匹配，使用 Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建如下網(wǎng)絡(luò)：(1)枳實(shí)薤白桂枝湯及人參湯的活性成分—藥物潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖；(2)枳實(shí)薤白桂枝湯及人參湯治療心絞痛的活性成分—疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過計算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的介數(shù)中心性(betweenness centrality)以及度(degree)，評價分析枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯的關(guān)鍵化合物以及靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[11]進(jìn)行共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)、枳實(shí)薤白桂枝湯特有治療心絞痛網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)、人參湯特有治療心絞痛網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”(人)，置信度得分≥0.4，獲得最終的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從共有靶點(diǎn)與特有靶點(diǎn)不同屬性角度解釋“同病異治”的科學(xué)內(nèi)涵。

1.6 生物過程通路富集分析

運(yùn)用R 3.6.1軟件對交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO生物過程以及KEGG信號通路分析，ClusterProfiler是基于R語言開發(fā)的Bioconductor軟件包，可以對基因集合或基因cluster進(jìn)行功能聚類的統(tǒng)計分析和可視化。設(shè)定pvalueCutoff=0.05，進(jìn)行GO以及KEGG通路富集分析，篩選排名前二十的GO生物學(xué)途徑，繪制柱狀圖和KEGG通路繪制氣泡圖，以找到枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)相關(guān)的重要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯中藥物活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測

借助TCMSP、Swiss Target Prediction和Drugbank數(shù)據(jù)庫，篩選高可信度的基因作為候選靶點(diǎn)。篩選結(jié)果如下：枳實(shí)薤白桂枝湯的藥物活性成分和靶點(diǎn)數(shù)分別是43個和200個；人參湯的藥物活性成分和靶點(diǎn)數(shù)分別是111個和212個(表1)。

表1 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯成分—靶點(diǎn)的基本信息

通過對比分析，兩復(fù)方共有的藥物活性成分和靶點(diǎn)數(shù)分別是4個和183個。枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯的成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括379個節(jié)點(diǎn)，1891條邊，其中紅色代表人參湯的活性成分，綠色代表枳實(shí)薤白桂枝湯的活性成分，紫色代表兩個方中共有的活性成分，橙色代表人參湯潛在的作用靶點(diǎn)，黃色代表枳實(shí)薤白桂枝湯潛在的作用靶點(diǎn)，藍(lán)色代表兩復(fù)方共同的作用靶點(diǎn)，每條邊表示活性成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。從靶點(diǎn)角度來說，兩復(fù)方中存在多成分多靶點(diǎn)共同作用的機(jī)制，符合中藥復(fù)方的特點(diǎn)(圖1)。

圖1 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛作用靶點(diǎn)分析

通過全面查找6個疾病數(shù)據(jù)庫，共篩選得到219個相關(guān)的靶點(diǎn)，進(jìn)一步將藥物作用靶點(diǎn)與心絞痛疾病靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯共有的183個靶點(diǎn)中有31個與心絞痛相關(guān)，占心絞痛疾病靶點(diǎn)數(shù)目的14.16%，而枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯與心絞痛相關(guān)的特有靶點(diǎn)均只有1個(圖2)，說明兩復(fù)方治療心絞痛的生物學(xué)基礎(chǔ)及其相似。枳實(shí)薤白桂枝湯中與心絞痛相關(guān)的活性成分有22個，人參湯中有67個，分別占該復(fù)方總活性成分的51.16%和60.36%。此外，兩復(fù)方共有的活性成分僅為4個，而與心絞痛相關(guān)的則有3個，說明兩復(fù)方治療心絞痛的作用機(jī)理可能存在高度的相似性。兩復(fù)方治療心絞痛的共有靶點(diǎn)中有30個可被naringenin、quercetin、beta-sitosterol三個共有活性成分作用，表明上述三個活性成分是兩復(fù)方治療心絞痛的關(guān)鍵藥物成分。三種成分主要存在于枳實(shí)、薤白、桂枝和甘草、人參、干姜6味藥當(dāng)中，一定程度上反映了這6味藥在治療心絞痛相關(guān)疾病中的關(guān)鍵作用。

圖2 藥物潛在作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

借助Cytoscape 3.7.1軟件對藥物活性成分—疾病作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，得到了包含122個節(jié)點(diǎn)，356條邊的網(wǎng)絡(luò)，其中黃色代表兩復(fù)方治療心絞痛的共同靶點(diǎn)，綠色代表人參湯治療心絞痛的特有靶點(diǎn)，粉色代表枳實(shí)薤白桂枝湯治療心絞痛的特有靶點(diǎn)，藍(lán)色代表兩復(fù)方治療心絞痛的共有活性成分，青色代表人參湯治療心絞痛的特有活性成分，紫色代表枳實(shí)薤白桂枝湯治療心絞痛的特有活性成分。每條邊則表示活性成分與靶點(diǎn)之間的靶向作用關(guān)系(圖3)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)度代表節(jié)點(diǎn)相連的邊數(shù)，以betweenness centrality和degree來評估節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，篩選連接活性成分或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中起到了樞紐的作用，可能為關(guān)鍵的活性成分或者靶點(diǎn)。在枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖中，靶點(diǎn)度排名靠前的有SCN5A、ADRB2、KCNH2、PON1、APOB等，分別與67、53、27、6、4個藥物活性成分發(fā)生相互作用。枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)鋵傩苑治銮?0位的靶點(diǎn)見表2。

表2 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯共有靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)

圖3 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯活性成分—作用靶點(diǎn)—疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)

使用String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建兩復(fù)方治療心絞痛共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)含有31個節(jié)點(diǎn)，203條邊，平均節(jié)點(diǎn)degree值為13.1(圖4)。以degree值作為該網(wǎng)絡(luò)核心基因分析的主要參考依據(jù)，篩選排名前15名的共有靶基因，其中度排名最靠前的6個分別是IL-6、VEGFA、CCL2、IL-10、IL-1B、SERPINE1(圖5)。另外，枳實(shí)薤白桂枝湯治療心絞痛特有靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖有32個節(jié)點(diǎn)，220條邊；人參湯治療心絞痛特有靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖有32個節(jié)點(diǎn)，207條邊。

圖4 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)(TOP15)

2.5 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)的KEGG通路分析

運(yùn)用R3.6.1對枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路分析。排除寬泛的通路，篩選排名前20的通路(表3)。本研究發(fā)現(xiàn)枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的共有靶點(diǎn)富集于HIF-1信號通路、IL-17信號通路、細(xì)胞因子及其受體的相互作用、NF-κB信號通路、Th17細(xì)胞分化上。這些信號通路被證明與心絞痛密切相關(guān)。

表3 枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.6 兩復(fù)方治療心絞痛核心靶點(diǎn)的KEGG通路分析

通過R 3.6.1軟件分別對兩復(fù)方治療心絞痛的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路的富集分析，枳實(shí)薤白桂枝湯治療心絞痛靶點(diǎn)的代謝通路前20名參見圖6；人參湯治療心絞痛靶點(diǎn)的代謝通路前20名參見圖7。結(jié)合上述分析可以看出富集的通路大致相似，表明兩復(fù)方治療心絞痛的作用機(jī)制可能主要依賴于其中的共有活性成分。

圖6 枳實(shí)薤白桂枝湯治療心絞痛作用靶點(diǎn)的KEGG通路分析

圖7 人參湯治療心絞痛作用靶點(diǎn)的KEGG通路分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，體外虛擬篩選中藥復(fù)方活性物質(zhì)，潛在作用靶點(diǎn)以及通路的現(xiàn)代化研究方法，其研究體現(xiàn)的整體性特點(diǎn)與中醫(yī)的整體觀念相契合，是中藥復(fù)方研究中的重要方法之一。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方的作用機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍規(guī)律、復(fù)方優(yōu)化、“效—毒”網(wǎng)絡(luò)等研究中均有廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是近代生物醫(yī)藥研究的哲學(xué)觀念與研究模式的革命性轉(zhuǎn)變[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯中共有的活性成分為4個，共有的靶基因187個，其中屬于共有活性成分對應(yīng)的靶基因有167個。兩復(fù)方治療心絞痛的共同靶基因有31個，其中屬于共有活性成分的靶基因有30個，說明3個共有活性成分在治療心絞痛方面最為關(guān)鍵。上述靶基因的主要作用為調(diào)控炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)離子通道等。炎癥相關(guān)因子是心血管疾病的中藥預(yù)測指標(biāo)[14]，不穩(wěn)定型心絞痛患者機(jī)體炎癥反應(yīng)活躍，在兩復(fù)方治療心絞痛的靶點(diǎn)中IFNG、IL-10、IL-6等[14]均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，提示兩復(fù)方可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)治療心絞痛。SCN5A是心臟鈉離子通道編碼基因的家庭成員，可以編碼心肌鈉離子通道的成孔離子傳到的α亞基[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A的突變與心房顫動、心律失常等多種心臟疾病密切相關(guān)[16-17]。ADRB2是G蛋白偶聯(lián)腎上腺素受體家族成員之一，可以特異性的結(jié)合內(nèi)源性配體，從而產(chǎn)生生物效應(yīng)[18]。ADRB2在心血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而ADRB2的突變可以導(dǎo)致心肌梗死或冠狀動脈疾病[19]。KCNH2是編碼快速激活延遲整流鉀離子通道蛋白α亞單位的基因，研究發(fā)現(xiàn)，該基因的突變是導(dǎo)致心律失常的重要基礎(chǔ)[20]。兩復(fù)方尚可調(diào)控PON1、APOB、LDLR等血脂代謝相關(guān)基因，APON1可降低低密度脂蛋白水平[21]，LDLR基因的缺失會導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成[22]，上文提到的ADRB2也被證明在脂類代謝中具有重要作用[23]。此外，大量研究表明芳香烴受體信號通路(AHR信號通路)與心血管疾病密切相關(guān)，該通路可以影響心臟功能、血管的發(fā)育以及調(diào)節(jié)血壓[24]，而在本研究中，與該條通路相關(guān)的基因包括AHR、CYP1A2、CYP1A1、CYP3A4、AHR信號通路的靶基因細(xì)胞色素P450超家族成員(如CYP1A1)、還原型輔酶Ⅱ、醌氧化還原酶和乙醛脫氫酶，這些靶基因與氧化代謝反應(yīng)密切相關(guān)，AHR基因的缺失還會影響VEFG等基因的表達(dá)。這些都提示了該通路可能是兩復(fù)方治療心絞痛的重要機(jī)制之一。此外，兩復(fù)方的共有靶點(diǎn)較多，但與心絞痛相關(guān)的靶點(diǎn)僅占14.16%，說明兩復(fù)方可能在其他疾病中仍存在“同病異治”的情況，臨床上可進(jìn)一步探索。

枳實(shí)薤白桂枝湯特有靶點(diǎn)為金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)，該基因是基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo protein-9,MMP-9)活性的主要抑制物，MMP-9是粥樣斑塊破裂的中藥促進(jìn)因素，兩者間的平衡是維持細(xì)胞外基質(zhì)完整性和改善血管重構(gòu)的關(guān)鍵。因此，TIMP1可能通過調(diào)控MMP-9，從而抑制斑塊破裂[22]。而人參湯的特有靶點(diǎn)為單胺氧化酸A(monoamine oxidase A,MAOA)，該基因?qū)π慕g痛的作用機(jī)制研究較少，但有大量研究表明，該基因與對5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、NE等具有較高親和力[25]，5-HT受體不僅可以調(diào)控心臟傷害性感受以及早期動脈粥樣硬化，因此MAOA可能通過作用于5-HT，從而在心絞痛的治療中發(fā)揮作用。以上所述從側(cè)面說明了枳實(shí)薤白桂枝湯用于胸痹急性期，而人參湯用于胸痹緩解期(調(diào)養(yǎng)期)的說法。

KEGG通路的富集結(jié)果顯示，兩復(fù)方治療心絞痛相關(guān)的信號通路包括低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)、IL-17、細(xì)胞因子及其受體的相互作用、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、輔助性T細(xì)胞17(T helpercell 17,Th17)細(xì)胞分化等信號通路，這些信號通路均被驗(yàn)證與心絞痛的發(fā)病相關(guān)。有研究指出HIF-1α在心臟保護(hù)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[26]，該基因有助于組織重塑[27]。NF-κB通路可以通過調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞存活發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]，在不穩(wěn)定型心絞痛患者的外周單核細(xì)胞中可被選擇性激活，兩復(fù)方治療心絞痛可能通過抑制該信號通路從而抑制炎癥反應(yīng)，可能是治療心絞痛的潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步闡明枳實(shí)薤白桂枝湯和人參湯“皆主胸痹”的作用機(jī)制，揭示了中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療優(yōu)勢，為后續(xù)兩復(fù)方的分子機(jī)制研究提供了新線索，也為中醫(yī)藥“異病同治”研究提供了新思路。