向玲，彭玲瓏

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400000)

0 引言

食管癌是一種發(fā)生率及死亡率較高的腫瘤，免疫治療對(duì)食管癌的治療價(jià)值有限[1]。腫瘤突變負(fù)荷是指每百萬個(gè)堿基中檢測到的體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、基因插入、缺失及替代的堿基總數(shù)[2]。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，大量的體細(xì)胞突變積累在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生新抗原，這種新抗原可以被患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別[3]。因此，腫瘤突變負(fù)荷可作為腫瘤免疫治療應(yīng)答反應(yīng)的獨(dú)立生物標(biāo)志物[4]，但是，目前尚不清楚與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)高突變頻率的基因在食管癌預(yù)后及浸潤免疫細(xì)胞中的作用。本研究擬系統(tǒng)性評(píng)估腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)基因在食管癌預(yù)后及浸潤免疫細(xì)胞中的價(jià)值。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

美國食管癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(http：//portal.gdc.cancer.gov/projects)。中國食管癌患者的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)來源于ICGC(http：//dcc.icgc.org/releases/current/Projects)數(shù)據(jù)庫。

1.2 腫瘤突變負(fù)荷的定義

腫瘤突變負(fù)荷為每兆堿基中引起氨基酸變化的突變堿基總數(shù)。通過腫瘤突變負(fù)荷的計(jì)算公式計(jì)算每個(gè)TCGA食管癌樣品中腫瘤突變負(fù)荷的表達(dá)值[2]。

1.3 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析均通過R軟件(v4.0.2)完成。使用Perl軟件分別提取了TGCA和IGGC數(shù)據(jù)庫中突變頻率最高的30個(gè)基因。通過R包“venn”在獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中的高突變頻率的交叉突變基因。使用R包“ggpubr”評(píng)估并可視化這些交叉突變基因與TMB之間的關(guān)系。使用CIBERSORT反卷積算法，將過濾條件設(shè)置為P＜0.05，獲得每個(gè)TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌樣品的免疫細(xì)胞比例的矩陣數(shù)據(jù)。根據(jù)CSMD1的突變狀態(tài)，將TCGA樣品分為野生組和突變組。兩組之間浸潤免疫細(xì)胞的差異分析通過R軟件包“l(fā)imma”進(jìn)行，并通過R軟件包“vioplot”進(jìn)行可視化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Kaplan-Meier生存曲線分析對(duì)與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因進(jìn)行預(yù)后分析。通過未配對(duì)t檢驗(yàn)評(píng)估CSMD1突變型組和CSMD1野生型組浸潤免疫細(xì)胞的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌的體細(xì)胞突變特征

TCGA數(shù)據(jù)庫182例食管癌樣本突變數(shù)據(jù)分析顯示：錯(cuò)義突變?yōu)槭彻馨┗颊咦钪饕耐蛔冃问剑琶?位的突變基因分別是 TP53，TTN，MUC16，CSMD3及 SYNE1(圖 1A)。ICGC數(shù)據(jù)庫297例食管癌樣本突變數(shù)據(jù)分析顯示：中國患者中普遍發(fā)生錯(cuò)義突變，其中TP53，TTN，MUC16，NOTCH1和CSMD3基因在中國患者中的突變頻率位居前5位(圖1B)。

2.2 鑒定與食管癌腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因

將TCGA及ICGC數(shù)據(jù)庫中突變頻率最高的前30個(gè)基因取交集，獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中共同突變基因。結(jié)果顯示：具有高突變頻率的共同突變基因共18個(gè)基因(圖2A)。根據(jù)這18個(gè)交叉突變基因的突變狀態(tài)，將來自TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌患者分為野生組和突變組。通過對(duì)基因突變矩陣和TMB表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)行整合分析，結(jié)果顯示：18個(gè)共同突變基因中，其中10個(gè)基因的腫瘤突變負(fù)荷表達(dá)量在野生組及突變組之間差異明顯，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2B)。與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因分別是TNN，MUC16，CSMD3，PCLO，LRP1B，SYNE1，RYR2，USH2A，CSMD1和 SPTA1基因 (圖 2B)。

2.3 CSMD1突變與食管癌預(yù)后相關(guān)

根據(jù)篩選出的10個(gè)與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因的突變狀態(tài)，將TCGA數(shù)據(jù)庫中的食管癌患者分為野生組和突變組，并結(jié)合患者生存數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示，10個(gè)與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因中，只有CSMD1突變與食管癌預(yù)后相關(guān)。CSMD1突變型的患者預(yù)后更差，CSMD1野生型的患者預(yù)后更好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.029)(圖 3)。

2.4 食管癌中與CSMD1突變相關(guān)的浸潤免疫細(xì)胞

根據(jù)CSMD1基因的突變狀態(tài)，將TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌患者分為CSMD1野生型組和CSMD1突變型組，使用CIBERSORT反卷積算法，計(jì)算兩組之間浸潤免疫細(xì)胞含量。結(jié)果顯示：與CSMD1野生型組患者相比，CSMD1突變型組患者的激活記憶CD4 T細(xì)胞及激活NK細(xì)胞的浸潤比例更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討論

圖3 10個(gè)與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)的突變基因的生存曲線

圖4 CSMD1突變型組與野生型組患者之間22種浸潤免疫細(xì)胞的含量

食管癌在我國癌癥發(fā)病率中位居第四位。目前其治療方式包括手術(shù)、內(nèi)鏡、化療、靶向及免疫治療等多種治療方式[1]。免疫治療主要針對(duì)晚期食管癌患者，其療效尚處于探索階段。CSMD1基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，其表達(dá)缺失或功能異常與人類多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。目前已經(jīng)證實(shí)CSDM1作為黑素瘤細(xì)胞中的抑癌基因，可通過與Smad3相互作用，激活Smad1、Smad2和Smad3，在黑素瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。一項(xiàng)對(duì)來自頭頸部、肺、乳腺和皮膚的原發(fā)性腫瘤的基因拷貝數(shù)進(jìn)行表征的研究表明，這些癌癥中均或多或少存在CSMD1表達(dá)丟失及功能缺失[6]。與正常的乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中CSMD1的表達(dá)降低，且其低表達(dá)與腫瘤分級(jí)及患者總體生存率相關(guān)[7]。在對(duì)結(jié)直腸癌突變基因分析中，F(xiàn)arrell等人確定了5個(gè)CSMD1非同義體細(xì)胞突變，且這些突變主要發(fā)生在晚期結(jié)直腸腫瘤中，提示CSMD1突變在晚期轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[8]。在本研究中，我們的結(jié)果顯示，CSMD1突變不僅在食管癌中普遍發(fā)生，且與腫瘤突變負(fù)荷及患者預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤突變負(fù)荷可作為判定腫瘤免疫治療應(yīng)答反應(yīng)的生物標(biāo)志物，因此，我們進(jìn)一步分析了CSMD1突變型及野生型患者中浸潤免疫細(xì)胞含量，結(jié)果顯示，與CSMD1野生型組患者相比，CSMD1突變型組患者的激活記憶CD4 T細(xì)胞及激活NK細(xì)胞的浸潤比例更高。CD4 T細(xì)胞又稱為輔助性T細(xì)胞，主要通過分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷能力，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。而在晚期腫瘤中，腫瘤細(xì)胞會(huì)自發(fā)性下調(diào)MHC-Ⅰ分子的表達(dá)來逃脫CD8 T細(xì)胞的殺傷作用情況，機(jī)體可通過不依賴MHC-Ⅰ作用形式的NK細(xì)胞作為殺傷腫瘤細(xì)胞的主力軍[10]。因此，我們推測，CSMD1突變型組患者中高浸潤比例的激活記憶CD4 T細(xì)胞及激活NK細(xì)胞，有助于食管癌的抗腫瘤免疫治療。綜上，CSMD1突變可以作為預(yù)測食管癌預(yù)后及免疫反應(yīng)的生物標(biāo)志物。