孔憶寒，龐靜靜，趙麗玲，母心靈，劉 偉

( 1. 鄭州市第一人民醫(yī)院，河南 鄭州 450004；2. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；3. 河南省胸科醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

非小細(xì)胞肺癌占全球新診斷肺癌病例的80%～85%，并且非小細(xì)胞肺癌在所有肺癌中的治愈率較低，死亡率最高[1-6]。奈達(dá)鉑(NDP)是第2代基于鉑的治療藥物[7-9]。與順鉑相比，NDP的水溶性要高10倍，并且毒理學(xué)特性得到改善。NDP的藥代動(dòng)力學(xué)特性與卡鉑相似。然而，與順鉑和卡鉑相比，其腎毒性有所降低[7-8，10]。但是NDP在治療劑量下是有毒的，這限制了其臨床應(yīng)用。熱療(HT)相關(guān)的臨床試驗(yàn)表明，其可以增強(qiáng)許多藥物的抗腫瘤作用[11]，并且HT和化療的協(xié)同作用受所用溫度的影響[12]。因此我們將具有靶向性的水溶性半乳糖基化殼聚糖(GC)作為載體制備奈達(dá)鉑-半乳糖基化殼聚糖微球(NDP-GC MP)，然后將其與HT聯(lián)合作用于人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1，以初步探討在非小細(xì)胞癌中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器人肺鱗癌細(xì)胞系SK-MES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院；最低必需培養(yǎng)基(MEM)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)購(gòu)自鄭州德雅生物科技有限公司；DHP-9032型電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ECLIPSE 80i型熒光顯微鏡，日本Nikon公司；BD FASS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 交聯(lián)的NDP-GC微球的制備 準(zhǔn)確量取液體石蠟22 mL，并向其加入分散劑span80 450 μL，于磁力攪拌器中攪拌(600 r/min)后超聲去除氣泡，靜置作為油相；配置10 mg/mL的GC溶液并取3 mL超聲去除氣泡，靜置作為水相，向水相中加入NDP 20 mg；將NDP-GC溶液滴加到油相中，以形成油包水乳液，繼續(xù)磁力攪拌溶液2 h。將體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛作為交聯(lián)劑添加到溶液中，并將溶液攪拌3 h。然后將得到的微粒懸浮液離心(3 000 r/min，20 min)，最后用石油醚、乙醇和雙蒸餾水洗滌。

1.2.2 微球的理化特性 將NDP-GC微球分散在乙醇中并將分散體滴在鋁箔上，然后常壓下干燥。將干燥的樣品于真空下濺射到鍍膜金上后用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察測(cè)量。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將SK-MES-1細(xì)胞在MEM中培養(yǎng)，并補(bǔ)充適量的100 mg/mL 鏈霉素、100 u/mL青霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%丙酮酸鈉，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的潮濕環(huán)境中于孵育。

1.2.4 體外細(xì)胞毒性測(cè)定

1.2.4.1 不同溫度對(duì)細(xì)胞毒性的影響 CCK-8測(cè)定法是用于檢測(cè)細(xì)胞增殖、活力和毒性的一種常用檢測(cè)方法。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到80%～90%后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-EDTA將細(xì)胞從燒瓶中分離，離心(1 000 r/min，5 min)收集細(xì)胞沉淀，然后除去上清液。將細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基中，并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。將SK-MES-1細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種到96孔板中，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)。24 h后，將細(xì)胞用不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64或128 μg/mL)的NDP處理。應(yīng)用不同的溫度來(lái)研究細(xì)胞對(duì)熱損傷的敏感性。A組于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48 h。B組、C組和D組放入水浴中(溫度分別為41 ℃、42 ℃和43 ℃)各保持1 h，然后將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)23或47 h，并在孵育24或48 h后檢測(cè)。此后，每個(gè)孔中各加入CCK-8溶液10 μL，并將板溫育4 h。使用自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下讀取結(jié)果，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.4.2 不同HT處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞毒性的影響 將SK-MES-1細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，并在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。用不同濃度(0、1、2、4、8、16、32、64或128 μg/mL)的NDP處理A～D組，然后將其置于43 ℃的水浴中分別保持0.5、1、1.5或2 h，在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，然后在24或48 h檢測(cè)。

相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于探討NDP-GC MP對(duì)非小細(xì)胞肺癌的影響。將NDP-GC微球設(shè)置為不同的濃度(0、1、2、4、8、16、32、64或128 μg/mL)。將細(xì)胞用NDP-GC微球處理，置于43 ℃的水浴中2 h，于37 ℃回收，然后在24或48 h進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞周期和凋亡測(cè)定 為了闡明HT和NDP-GC MP的作用機(jī)制，我們使用流式細(xì)胞儀確定暴露于不同濃度的NDP/NDP-GC MP加熱或不加熱的SK-MES-1細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡。將MEM培養(yǎng)基中的4×105SK-MES-1細(xì)胞接種到6孔板中，并在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的條件下生長(zhǎng)。將細(xì)胞用32 μg/mL NDP/NDP-GC MP處理24 h，將未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。A組板直接放入培養(yǎng)箱中于培養(yǎng)24 h，B組板首先在43 ℃的水浴中孵育2 h，然后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22 h檢測(cè)。通過(guò)胰蛋白酶消化和離心收集附著的細(xì)胞，收集的細(xì)胞先用PBS洗滌3次，然后在70 ℃的乙醇中于-20 ℃固定16～18 h。固定的細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，并用PI染色30 min。使用流式細(xì)胞儀分析染色的細(xì)胞。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡分析 將SK-MES-1細(xì)胞預(yù)先用0、32 μg/mL NDP/NDP-GC MP進(jìn)行加熱或不加熱(43 ℃，2 h)處理，然后用PBS洗滌3次，收集并用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒染色。然后將5 μL PI加入到溶液中，在室溫下培養(yǎng)15 min。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果

2.1 NDP-GC微球的掃描電鏡觀察經(jīng)乳化-化學(xué)交聯(lián)法合成的NDP-GC微球外表光滑致密，少數(shù)出現(xiàn)外表不平整現(xiàn)象，可能是由于干燥過(guò)程中微球黏連現(xiàn)象造成的。

2.2 體外細(xì)胞毒性NDP的細(xì)胞毒性是具有時(shí)間和劑量依賴性的，并且其對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨溫度的升高而增加。在不同溫度下的實(shí)驗(yàn)表明，抑制率在43 ℃下持續(xù)48 h最高。培養(yǎng)24 h時(shí)在不同溫度(37、41、42和43 ℃)下的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為80.22、53.15、42.12和35.78 μg/mL，培養(yǎng)48 h時(shí)分別為298.54、209.66、159.15和118.10 μg/mL。另外在43 ℃(0.5、1、1.5和2 h)的不同持續(xù)時(shí)間內(nèi)測(cè)量了抑制率，結(jié)果表明隨著加熱持續(xù)時(shí)間的增加，NDP的細(xì)胞毒性也增加，當(dāng)加熱時(shí)間增加到2 h時(shí)，IC50值降低了大約1/6。NDP-GC MP對(duì)SK-MES-1細(xì)胞的抑制率比單獨(dú)使用NDP時(shí)要高得多。GC微球?qū)K-MES-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性<10%，這表明本研究中制備的載體材料相對(duì)安全，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見圖1～4。

圖1 不同溫度下SK-MES-1細(xì)胞對(duì)NDP的敏感性

圖2 不同加熱時(shí)間下SK-MES-1細(xì)胞對(duì)NDP的敏感性

圖3 SK-MES-1細(xì)胞對(duì)NDP-GC MP的敏感性

圖4 GC微球?qū)K-MES-1細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.3 細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞儀用于測(cè)量細(xì)胞DNA含量以進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)NDP/NDP-GC MPs和單獨(dú)HT與兩者聯(lián)合時(shí)存在顯著差異。聯(lián)合治療后，G2/M期的細(xì)胞比例明顯更高，使細(xì)胞停滯于G2/M期。見圖5。

圖5 不同條件處理后SK-MES-1細(xì)胞周期分布

2.4 細(xì)胞凋亡分析單獨(dú)NDP/NDP-GC MP和單獨(dú)HT與兩者聯(lián)合時(shí)都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是凋亡速率明顯不同。HT、NDP、NDP-GC MP、NDP + HT和NDP-GC MP + HT凋亡率分別為(1.2±0.2)%、(25.0±1.2)%、(40.4±2.1)%、(46.0±2.7)%和(72.1±2.7)%?？梢娂?xì)胞凋亡率與HT有關(guān)，而且NDP-GC MP+ HT聯(lián)合組的凋亡率明顯高于其他組，約為NDP組的3倍。

3 討論

本研究首先使用乳化-化學(xué)交聯(lián)法將NDP與半乳糖基化殼聚糖組合為載體，制成NDP-GC微球，以增加NDP的靶向作用并降低其毒性。此外，SK-MES-1細(xì)胞可以高表達(dá)半乳糖凝集素[13]，因此NDP-GC MP可以通過(guò)半乳糖受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用，靶向肺鱗狀細(xì)胞癌，因此NDP-GC MP是在肺中具有雙重靶標(biāo)的微球。

此外，HT通常與常規(guī)抗腫瘤藥物聯(lián)合使用以增強(qiáng)藥物敏感性和細(xì)胞毒性[14]。然而，由熱引起的細(xì)胞毒性的類型和頻率高度依賴于所達(dá)到的細(xì)胞類型和溫度[15]。我們研究了NDP/NDP-GC MP和HT聯(lián)合應(yīng)用中的3個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：溫度、受熱持續(xù)時(shí)間和NDP濃度。首先，我們比較了SK-MES-1細(xì)胞對(duì)NDP的敏感性，因?yàn)榕R床上已證明NDP具有抗非小細(xì)胞肺癌的活性，但尚無(wú)NDP/NDP-GC MP與HT聯(lián)合用于治療肺鱗癌的報(bào)道。細(xì)胞毒性結(jié)果表明，NDP/NDP-GC MP的抗腫瘤活性與劑量，溫度和加熱時(shí)間的增加呈正相關(guān)。

為了揭示NDP/NDP-GC MP和HT的結(jié)合在體外抑制SK-MES-1細(xì)胞的機(jī)制，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析了細(xì)胞周期的改變。結(jié)果表明，僅NDP/NDP-GC MP組和NDP/NDP-GC MP+HT組會(huì)干擾細(xì)胞周期進(jìn)程。NDP/NDP-GC MP和HT聯(lián)合治療可誘導(dǎo)G2/M期阻滯，從而明顯增加了G2/M細(xì)胞的比例。將NDP/NDP-GC MP與HT聯(lián)合以后，SK-MES-1細(xì)胞活力降低，從而產(chǎn)生了細(xì)胞抑制作用，即兩者聯(lián)合處理可誘導(dǎo)G2/M期阻滯促使細(xì)胞凋亡[16]?？傊?，HT與奈達(dá)鉑聯(lián)合可以有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移，促進(jìn)其凋亡，具有用于非小細(xì)胞肺癌治療的潛力。