楊 飛，紀 元，崔浩哲，王 穎，劉珊珊，鄧惠敏，范子彥，邊照陽，唐綱嶺，李中皓

1.國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6 號 450001

2.蘇州科技大學化學生物與材料工程學院，江蘇省蘇州市高新區(qū)科銳路1 號 215009

3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

烯酰嗎啉是巴斯夫公司開發(fā)的一種新型內吸治療性專用低毒殺菌劑［1］，其殺菌機制是通過破壞病菌細胞壁膜的形成，導致孢子囊壁的分解，從而使病菌死亡，主要用于預防和治療葡萄、西紅柿、煙草等農作物的霜霉病及晚疫病等［2］。由于其分子結構中含有C=C 雙鍵，烯酰嗎啉有兩個順反異構體（圖1）。

盡管立體異構體具有相似的物理和化學性質，但卻表現(xiàn)出截然不同的生物活性、毒性和其他性質［3-10］。如（Z）-辛硫磷對蚊蟲幼蟲的殺蟲活性比（E）-辛硫磷高約3 倍［11］。Piao 等［12］研究了3 種土壤中烯酰嗎啉的選擇性降解，結果表明，（E）-烯酰嗎啉的降解速度快于（Z）-烯酰嗎啉。Fan等［13］也研究了葡萄中烯酰嗎啉異構體的殘留量和降解情況，發(fā)現(xiàn)（E）-烯酰嗎啉的降解速度快于（Z）-烯酰嗎啉。立體異構體之間具有相似的物理和化學性質，因此很難通過傳統(tǒng)分析技術加以分離。在大多數(shù)情況下，立體異構體在常規(guī)分析中始終被視為一種化合物。非立體選擇性分析僅能提供部分信息，而這些信息不能為農藥的風險評估提供完整而可靠的數(shù)據(jù)。CORESTA 農用化學品咨詢委員會制定的農用化學品指導性殘留限量表中，烯酰嗎啉［（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉之和］的殘留限量被定為2 mg/kg。由于立體異構體農藥難以分離和純化，因此市場上銷售的大部分農藥均是不同異構體的混合物。使用高活性異構體的農藥，可以大大減少釋放到環(huán)境中的農藥總量［8］。因此，尋求一種新的、有效的立體選擇性分離方法極具挑戰(zhàn)性，同時，對促進評估這些農藥對人類、動物和環(huán)境構成的風險具有重要意義。目前，已有文獻報道高效液相色譜（HPLC）法可用于烯酰嗎啉的立體選擇性分析和測定［12］。但是，該方法分離效果差、保留時間長、靈敏度低，不適合常規(guī)分析。而且，分離過程中使用的大量有毒試劑（如甲醇、乙腈）對環(huán)境有害［14-15］。近年來，超臨界流體色譜法（SFC）作為一種新的分析技術引起了研究人員的廣泛關注［16-18］。由于SFC 使用低黏度的CO2作為主要流動相，其流速和分離速度均比HPLC 快。同時，SFC 僅使用少量的有機溶劑作為流動相的改性劑，有機溶劑消耗量低于HPLC［19-23］。這些優(yōu)點使得SFC 成為立體異構農藥分析的首選方法，已廣泛應用于農藥的立體選擇性測定和分離［24-27］。因此，采用超臨界流體色譜-串聯(lián)質譜（Supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，SFC-MS/MS）立體選擇性分離和測定了煙草中烯酰嗎啉的順反異構體，旨在為烯酰嗎啉順反異構體降解和代謝的進一步研究提供基礎，并可能為其他農藥的立體選擇性分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

10 個烤煙實際樣品全部來自2019 年度國家煙草專賣局農殘普查分析樣品。

烯酰嗎啉標準品（＞98.0%，德國Augsburg 公司）；（E）-烯酰嗎啉標準品、（Z）-烯酰嗎啉標準品（＞98.0%，天津阿爾塔科技有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙醇和異丙醇（色譜純，德國Chemicell 公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，上海安普實驗科技股份有限公司）；超純水（自制，電阻率≥18.2 MΩ·cm）；高純氬、高純氮（＞99.99%，鄭州源正特種氣體有限公司）。

ACQUITY 超高效合相色譜儀、ACQUITY TQD 四極桿串聯(lián)質譜儀（配電噴霧電離源）、Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱和Acquity UPC2 Trefoil AMY1 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美國Waters 公司）；Chiralcel IG-3 柱和Chiralcel OD-3柱（100 mm×3.0 mm，3.0 μm）（日本Daicel 公司）；分樣篩（孔徑2 mm×直徑10 cm，廣東開平萊雪倫模具有限公司）；5810-R 高速離心機（美國Eppendorf 公司）；VX200 渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；AEl63 電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；0.22 μm 有機相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

所有樣品在40 ℃烘箱中烘烤24 h 后研磨，并使用孔徑為2 mm 的分樣篩過濾，過濾后的粉末樣品貯存于棕色玻璃瓶中，于4 ℃下保存。

1.2.2 標準工作溶液

稱取10 mg 烯酰嗎啉標準品，用乙腈溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得到一級標準儲備液（1.0 mg/mL）。移取100 μL 一級標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到二級標準儲備液（10.0 μg/mL）。移取適量的二級標準儲備液并使用乙腈稀釋，制備烯酰嗎啉濃度為1 000、500、200、100、50 和20 ng/mL 的標準溶液（其中各異構體濃度為500、250、100、50、25 和10 ng/mL）。

取6 個1.5 mL 色譜瓶，分別加入200 μL 標準溶液和800 μL 乙腈，得到各異構體濃度分別為100、50、20、10、5 和2 ng/mL的溶劑標準工作溶液。

另取6 個1.5 mL 色譜瓶，加入200 μL 的標準溶液、600 μL 的乙腈和200 μL 的空白煙草提取物，得到各異構體濃度為100、50、20、10、5 和2 ng/mL的基質匹配標準工作溶液。所有溶液在-18 ℃保存。

1.2.3 加標樣品的制備

空白樣品在回收率實驗中用作空白對照基質，并用于制備基質匹配的標準工作溶液，應確保不含烯酰嗎啉。使用前，將空白煙草樣品研磨均勻，并過孔徑2 mm 分樣篩，在室溫下自然風干。通過添加相應體積的二級標準儲備液制備不同質量分數(shù)的加標樣品。然后在樣品中加入10 mL 甲醇，并機械振蕩10 min，以使目標物均勻分布在樣品中。將樣品放置于通風櫥中過夜，使溶劑在室溫下蒸發(fā)。

1.2.4 樣品分析

參考文獻［28］的方法對煙草樣品進行QuEChERS 處理：稱取2 g 煙草粉末樣品于50 mL具塞離心管中，加入超純水和乙腈，渦旋振蕩3 min；然后再加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，繼續(xù)渦旋振蕩3 min，靜置；移取1 mL 上清液，加入1.5 mL 離心管中，再加入無水硫酸鎂及PSA，渦旋振蕩、離心；上清液經(jīng)有機相濾膜過濾后，取200 μL 濾液，用800 μL 乙腈稀釋，進行SFC-MS/MS 檢測。分析條件：

色譜柱：Chiralcel OD-3 柱（100 mm×3 mm，3.0 μm）；動態(tài)背壓：13.79 MPa；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A 相為CO2，B 相為甲醇；洗脫條件：等度洗脫，V流動相A∶V流動相B=98 ∶2；流動相流速：2.0 mL/min；補償溶劑：0.1%（體積分數(shù)）甲酸的甲醇溶液，流速0.2 mL/min；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：2.8 kV；錐空氣流量：60 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；采集模式：多反應監(jiān)測（MRM）；定量分析離子對（m/z）：388.1＞165.1（碰撞電壓30 V，錐孔電壓41 V）；定性分析離子對（m/z）：388.1＞300.9（碰撞電壓20 V，錐孔電壓41 V）；質譜掃描方式：正離子掃描。依據(jù)每個色譜峰掃描15～20 個數(shù)據(jù)點且自動調整停留時間。利用Mass Lynx 4.1 軟件采集所有數(shù)據(jù)。

2 結果與討論

2.1 立體選擇性分離條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

考察了4 種不同的手性色譜柱（Acquity UPC2 Trefoil CEL2，Acquity UPC2 Trefoil AMY1，Chiralpak IG-3 和Chiralcel OD-3）對烯酰嗎啉順反異構體的分離能力，結果見圖2。在4 種色譜柱中，Acquity UPC2 Trefoil AMY1 和Chiralpak IG-3柱不能分離順反異構體。Acquity UPC2 Trefoil CEL2 和Chiralcel OD-3 柱均可實現(xiàn)順反異構體的基線分離，但是Acquity UPC2 Trefoil CEL2 柱分離得到的色譜峰峰形不光滑且峰太寬（圖2）。因此，在后續(xù)實驗中選擇Chiralcel OD-3 柱分離烯酰嗎啉順反異構體。

圖2 利用4 種不同色譜柱分離烯酰嗎啉異構體的SFC-MS/MS 色譜圖Fig.2 Typical SFC-MS/MS chromatograms of dimethomorph isomers separated on four columns

2.1.2 改性劑的影響

極性的有機改性劑對異構體立體選擇性分離的洗脫時間、分離度和洗脫順序均有重要影響［29-30］。為了在Chiralcel OD-3 柱上實現(xiàn)順反異構體的良好分離，考察了3 種不同有機改性劑（甲醇、乙醇和異丙醇）對順反異構體分離的影響。結果（圖3）表明，甲醇可以使兩種異構體基線完全分離且色譜峰形良好（圖3a）。相反，當使用乙醇時，烯酰嗎啉兩個異構體的峰形較差。使用異丙醇作為改性劑時，烯酰嗎啉順反異構體不能分開。因此，選擇甲醇作為流動相改性劑。

圖3 改性劑對烯酰嗎啉異構體分離的影響Fig.3 Effects of modifiers on separation of dimethomorph isomers

2.1.3 柱溫的影響

柱溫一直是影響超臨界流體色譜立體選擇性分離的重要因素之一。超臨界二氧化碳的密度和黏度隨柱溫升高而降低，導致流動相的洗脫能力下降，保留時間增加［31］?？疾炝酥鶞貜?5 ℃逐步升高到50 ℃（步長為5 ℃）時，烯酰嗎啉順反異構體的分離情況。結果如圖4 所示，保留時間隨溫度升高而增加。溫度對烯酰嗎啉順反異構體分離度的影響較小，但是當溫度從35 ℃升至40 ℃時，MS 響應信號明顯降低。考慮到保留時間和MS 響應信號，選擇35 ℃為最佳分離溫度。

圖4 柱溫對烯酰嗎啉異構體分離效果的影響Fig.4 Effects of column temperature on separation of dimethomorph isomers

2.1.4 動態(tài)背壓的影響

隨動態(tài)背壓升高，超臨界CO2流體密度增加，其對分析物的溶解和洗脫能力也隨之增強，因此目標物的保留時間減?。?2］?？疾炝藙討B(tài)背壓從11.03 MPa 逐步增加至15.17 MPa（步長為1.38 MPa）時，烯酰嗎啉順反異構體的分離情況。結果（圖5）表明，動態(tài)背壓的變化對順反異構體的分離度沒有影響；但是，動態(tài)背壓從11.03 MPa 增加到13.79 MPa，會導致MS 響應信號顯著增加。因此，選擇動態(tài)背壓13.79 MPa 作為推薦值。

圖5 動態(tài)背壓對烯酰嗎啉順反異構體分離情況的影響Fig.5 Effects of ABPR（auto back pressure regulator）on separation of dimethomorph isomers

2.1.5 烯酰嗎啉異構體的洗脫順序

在上述最優(yōu)化的實驗條件下，分別將（E）-和（Z）-烯酰嗎啉標準溶液注入SFC-MS/MS 系統(tǒng)中，（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉在Chiralcel OD-3 柱上的洗脫順序依次為（E）-烯酰嗎啉（3.68 min）、（Z）-烯酰嗎啉（4.15 min）。在最優(yōu)條件下，煙草實際加標樣品的選擇離子色譜圖如圖6所示。

圖6 加標樣品的典型SFC-MS/MS 色譜圖Fig.6 Typical SFC-MS/MS chromatogram of the spiked tobacco sample

2.2 方法驗證

2.2.1 基質效應

基質效應（ME）是由共洗脫的基質組分產(chǎn)生的，這些組分會影響目標分析物的電離，在某些情況下會導致目標分析物離子抑制或離子增強［33］。通過溶劑標準工作溶液與基質匹配標準工作溶液進行比較研究基質效應。如表1 所示，（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉的基質效應分別為-59.8%和-69.3%，表明其信號被強烈抑制。因此，使用基質匹配的標準工作曲線進行定量以獲得準確結果。

2.2.2 線性方程、檢出限和定量限

通過分析溶劑標準工作溶液和相應的基質匹配標準工作溶液（2～100 ng/mL）考察方法的線性。通過繪制順反異構體峰面積與濃度的關系圖生成校準曲線。通過使用低濃度的加標樣品確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），分別以信噪 比（S/N）為3 和10時的濃度定義為LOD 和LOQ。如表1所示，各異構體線性關系良好（R2≥0.994 3），（E）-烯酰嗎啉和（Z）-烯酰嗎啉的LOD和LOQ 均較低，可以滿足定量分析的需要。

表1 烯酰嗎啉順反異構體的線性方程、基質效應、檢出限和定量限Tab.1 Regression equation，matrix effect，LODs，and LOQs for the isomers of dimethomorph

2.2.3 準確度和精密度

回收率實驗用于評估該方法的準確性和精密度。制備3 個不同濃度（分別為0.02、0.2 和2.0 mg/kg）的加標樣品，依據(jù)上述步驟提取和凈化，每個濃度樣品平行測定5 次，連續(xù)測定3 d。使用相對標準偏差（RSD）評估該方法的精密度。如表2 所示，在所有加標水平下均獲得滿意的平均回收率（87.3%～102.3%）。方法的日內精密度（n=5）和日間精密度（n=15）分別為2.7%～4.9%和3.3%～5.9%。

表2 方法的準確度和精密度Tab.2 Accuracies and precisions of the proposed method

2.3 方法的應用

采用本方法測定了10 個來自不同產(chǎn)區(qū)的煙草樣品，結果顯示：僅在1 個樣品中檢出（E）-和（Z）-烯酰嗎啉，二者的質量分數(shù)分別為1.18 和1.22 mg/kg。該結果也表明，烯酰嗎啉在煙草上施用時是以異構體混合物的形式存在的。

3 結論

①建立了超臨界流體色譜-串聯(lián)質譜分離和測定煙草中烯酰嗎啉順反異構體的方法，該方法主要以CO2為流動相，在5 min 內即可實現(xiàn)烯酰嗎啉順反異構體的基線分離。②在最優(yōu)化的分離條件下，烯酰嗎啉順反異構體的回收率在87.3%～102.3%之間，日內精密度為2.7%～4.9%，日間精密度為3.3%～5.9%。③該方法具有綠色、快速、靈敏度高、選擇性強、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，已成功應用于分離和測定煙草實際樣品中的烯酰嗎啉異構體。