李 梅，楊 鵬，岳 筠，宋 春，成虹松，陳 靜 ，尹德晶，張雙翔*，程振濤*，李鳳龍

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008；3. 遵義市紅花崗區(qū)海龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 遵義 563000)

2020年10月，貴州省銅仁市某蛋雞場(chǎng)雞群出現(xiàn)零星死亡，幾天后死亡數(shù)量急劇增加，在7天內(nèi)死亡1 000余只，死亡率達(dá)21%。經(jīng)調(diào)查，該場(chǎng)發(fā)病蛋雞主要為11月齡；剖檢病死雞可見(jiàn)心包內(nèi)充滿淡黃色液體，肝臟充血腫大，喉頭出血。為了查明病因，特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)診斷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料無(wú)菌采集該場(chǎng)3只病死雞的心臟、肝臟、脾臟、氣管、腦組織作為檢測(cè)病料。

1.2 主要試劑新城疫病毒(NDV)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒、禽流感病毒(AIV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)；2×TaqPCR MasterMix(購(gòu)自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；鮮血瓊脂培養(yǎng)基(自制)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(bio-rad CFX connect，購(gòu)自美國(guó)bio-rad公司)、多功能梯度PCR儀(VeritiTM96-Well Thermal Cycler，購(gòu)自ABI公司)。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌條件下取采集的肝臟、心臟、脾臟組織樣品(鮮樣)，分別劃線接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.5 組織樣品DNA/RNA提取分別取3只雞的心臟、肝臟、脾臟、氣管、腦組織病料各1 g于滅菌研缽中，加入生理鹽水1.5 mL快速研磨，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA試劑盒按說(shuō)明書(shū)方法于室溫環(huán)境提取總DNA/RNA。

1.6 相關(guān)病原核酸檢測(cè)

1.6.1 NDV核酸檢測(cè)以提取的總RNA為模板，構(gòu)建 qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：無(wú)菌無(wú)核酸酶水2.6 μL，qRT-PCR反應(yīng)液10 μL，酶混合液0.4 μL，熒光探針2.0 μL，模板RNA 5 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循環(huán)第2步(60 ℃ 35 s)收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)，以陽(yáng)性對(duì)照Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，且陰性對(duì)照無(wú)Cq值作為實(shí)驗(yàn)成立判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.2 AIV核酸檢測(cè)以提取的總RNA為模板，構(gòu)建 qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL： 無(wú)菌無(wú)核酸酶水2.8 μL，qRT-PCR反應(yīng)液10 μL，酶混合液0.4 μL，熒光探針1.8 μL，模板RNA 5 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循環(huán)第2步(60 ℃ 35 s)收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)，以陽(yáng)性對(duì)照Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，且陰性對(duì)照無(wú)Cq值作為實(shí)驗(yàn)成立判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.3 雞安卡拉病毒(FAdV-4)核酸檢測(cè)以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。引物序列：FAdV-4-F：5’-CCCAAGCTTATGTCGGCCCTA ATCGCCT-3’；FAdV-4-R：5’-TGCTCTAGAGGC CAAAGTATCGTCATCGATGAGCAG-3’；Tm值61 ℃。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳(110 V 30 min)，凝膠成像儀上觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段366 bp)。

1.7 雞毒支原體(MG)核酸檢測(cè)以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：MG-F：5’-ATG AAAGCTAGTATCTATAAA-3’；MG-R：5’-TTATCTT TGGTTGTTAAATTCAG-3’；Tm值56 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(110 V 30 min)，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段639 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果3只病死雞組織樣品在鮮血瓊脂培養(yǎng)基中均無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明無(wú)細(xì)菌感染。

2.2 相關(guān)病原核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 NDV核酸檢測(cè)由圖1可見(jiàn)：陽(yáng)性對(duì)照Cq值為25，3個(gè)檢測(cè)樣品均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線和Cq值，提示組織樣品中不存在NDV感染。

+：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照； 1～3：檢測(cè)樣品圖1 NDV qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 AIV核酸檢測(cè)由圖2可見(jiàn)：陽(yáng)性對(duì)照Cq值為27，而3個(gè)檢測(cè)樣品Cq值均為0，且無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，提示組織樣品中不存在AIV感染。

+：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照； 1～3：檢測(cè)樣品圖2 AIV qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 FAdV-4核酸檢測(cè)由圖3可見(jiàn)：3個(gè)檢測(cè)樣品PCR均擴(kuò)增出366 bp目的基因片段，與陽(yáng)性對(duì)照相符，提示組織樣品中存在FAdV-4感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； -：陰性對(duì)照； 1～3：檢測(cè)樣品； +：陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D3 FAdV-4 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 MG核酸檢測(cè)由圖4可見(jiàn)：3個(gè)檢測(cè)樣品中有1個(gè)樣品PCR擴(kuò)增出639 bp目的基因片段，與陽(yáng)性對(duì)照相符，提示1 個(gè)組織樣品中存在MG感染。另外2個(gè)樣品中無(wú)MG感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； -：陰性對(duì)照； 1～3：檢測(cè)樣品； +：陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D4 MG PCR檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)3只病死雞采集病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和相關(guān)病原核酸檢測(cè)，確診該蛋雞場(chǎng)病例存在雞毒支原體與雞安卡拉病毒混合感染。建議該蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)用抗病毒藥物聯(lián)合抗支原體藥物控制疫情，并做好相關(guān)無(wú)害化處理及凈化工作。

4 討論

近年來(lái)，貴州省蛋雞產(chǎn)業(yè)在相關(guān)政策的大力扶持下得以迅速發(fā)展，但由于發(fā)展過(guò)程中飼養(yǎng)管理、生產(chǎn)技術(shù)、疫病防控、環(huán)境污染等問(wèn)題，致使蛋雞疫病不斷發(fā)生且多種疫病混合感染日趨嚴(yán)重。常見(jiàn)的病原有禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、安卡拉病毒(FAdV-4)，雞毒支原體(MG)、滑液囊支原體(MS)等[1，2]。雞毒支原體病是由MG引起的1種慢性呼吸道傳染病，以發(fā)生呼吸道癥狀為主，病程長(zhǎng)，病死率低，但可致幼雞生長(zhǎng)緩慢，蛋雞產(chǎn)蛋下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3，4]。雞安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ 群 C種血清4型(FAdV-4)引起的以心包積液、肝臟腫大出血為主要特征的疾病，又稱心包積液-肝炎綜合癥[5]。2015年以來(lái)，全國(guó)各地關(guān)于雞心包積水綜合征(安卡拉病)的病例報(bào)道陸續(xù)增多，傳染性強(qiáng)，死亡率高，給養(yǎng)殖戶造成很大損失[6]。本次檢測(cè)也證實(shí)該病在我省存在，且為在蛋雞群中發(fā)生。此外本次檢測(cè)結(jié)果還表明蛋雞群存在雞毒支原體混合感染，需要加強(qiáng)該病的凈化工作。對(duì)于發(fā)生混合感染的雞群，臨床癥狀與病理變化復(fù)雜，因此雞場(chǎng)在發(fā)病初期就應(yīng)迅速送檢，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷盡快確診病因，對(duì)癥對(duì)因正確處理，以免延誤病情造成更大的損失。