張黔東，王 微，袁 陽(yáng)，曾茂芹，劉妍罕，楊 穎，2，3，溫貴蘭，2，3，程振濤，2，3，文 明，2，3*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3. 貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

miRNA(或microRNA)是廣泛分布于真核生物和動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)度約為 22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，位于基因組非編碼區(qū)，最早在線蟲中被發(fā)現(xiàn)[1]。miRNA能夠與靶基因mRNA非編碼區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合，通過(guò)阻止翻譯或降解mRNA實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)基因的功能[2]。近年研究表明，病毒感染能夠引起宿主miRNA的變化，miRNA不但能夠調(diào)控病毒的復(fù)制和致病性，還能夠調(diào)控宿主的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)揭示病毒感染后宿主miRNA表達(dá)譜的變化以尋找miRNA的調(diào)控機(jī)制，對(duì)研究病毒的致病機(jī)制具有重要作用。病毒在自然界中廣泛存在，其中動(dòng)物病毒種類繁多，多數(shù)對(duì)宿主有致病作用，常引起疫病流行，造成重大損失，如口蹄疫病毒、流感病毒、狂犬病病毒等，有的還可引起腫瘤，如雞馬立克氏病病毒、禽白血病病毒等?，F(xiàn)將miRNA參與調(diào)控多種病毒復(fù)制的研究情況介紹如下，供參考。

1 miRNA簡(jiǎn)介

miRNA是由內(nèi)源性基因編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，可負(fù)調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，最終導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[3]。miRNA調(diào)控具有多樣性和復(fù)雜性，1個(gè)miRNA可與1個(gè)或多個(gè)靶基因的3’UTR結(jié)合，1個(gè)靶基因也可被多個(gè)miRNA調(diào)控[4]。miRNA的作用機(jī)制主要有以下幾個(gè)過(guò)程：首先在細(xì)胞核中原始miRNA經(jīng)Drosha和輔助因子DGCR-8復(fù)合體的處理，形成pri-miRNA，之后去除帽子和尾巴結(jié)構(gòu)，形成長(zhǎng)度為60～75 nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)由Dicer酶剪切形成成熟的miRNA，miRNA與胞質(zhì)中RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 結(jié)合，形成miRNA沉默復(fù)合體，進(jìn)而發(fā)揮作用。miRNA沉默復(fù)合體5’端6～8個(gè)核苷酸與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-Untranslated region，3’-UTR)特異性結(jié)合，使靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[5]。

2 miRNA與病毒感染

病毒感染是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的生物因素之一，甚至造成動(dòng)物的死亡。研究表明，病毒感染宿主后2種不同來(lái)源的miRNA參與病毒基因的調(diào)控：1種是宿主細(xì)胞編碼的miRNA(宿主miRNA)；另外1種是病毒編碼的miRNA。前者主要通過(guò)天然免疫通路、炎癥因子和細(xì)胞凋亡等間接參與病毒的復(fù)制、感染及致病過(guò)程[6]。后者則通過(guò)調(diào)控病毒自身基因，幫助病毒潛伏或逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別[7]。

2.1 miRAN與流感病毒流感病毒(Influenza virus，IV)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表種，包括人流感病毒和動(dòng)物流感病毒，病毒顆粒多為球形(新分離的多為絲狀)，直徑為80～120 nm，有囊膜和纖突，呈核衣殼螺旋形對(duì)稱。基因組為線狀負(fù)鏈單股RNA，長(zhǎng)度為10 000～13 600 nt。近年研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒多個(gè)基因的保守區(qū)與宿主miRNA高度同源，這些病毒基因可作為宿主miRNA的潛在靶點(diǎn)。HA和NA是流感病毒的表面蛋白，HA的功能是參與病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，NA的功能在于當(dāng)病毒成熟釋放時(shí)，通過(guò)切割其表面上的糖基，協(xié)助病毒脫離宿主細(xì)胞[8]。研究發(fā)現(xiàn)，存在特定的宿主miRNA通過(guò)靶向病毒HA或NA抑制病毒復(fù)制增殖的作用。Zhang S等[9]研究表明，H7N9型流感病毒感染人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP后，miRNA Let-7e作用于細(xì)胞的Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)信號(hào)通路，上調(diào)IL-1和IL-6的表達(dá)，通過(guò)增強(qiáng)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答降低HA表達(dá)，從而抑制病毒的復(fù)制與增殖，證明宿主miRNA可作為潛在的免疫系統(tǒng)激活劑而發(fā)揮抗病毒作用。張森[10]篩選了與IAV(甲型流感病毒)感染有關(guān)的宿主miRNA分子，并以其中表達(dá)差異顯著的miR-203(micro RNA-203)分子為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)miR-203靶基因的篩選和驗(yàn)證，首次闡明了IAV感染過(guò)程中宿主miR-203與病毒之間的關(guān)系，解釋了IAV感染誘導(dǎo)miR-203表達(dá)的機(jī)制以及miR-203對(duì)病毒復(fù)制的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，豐富了流感病毒感染過(guò)程中宿主-病毒在miRNA水平的相互作用機(jī)理。

2.2 miRNA與新城疫病毒新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)，禽腮腺炎病毒(或禽副黏病毒)屬(Avulavirus)。病毒顆粒呈多形性(可呈絲狀)，直徑150～300 nm。有囊膜和纖突，纖突長(zhǎng)8～20 nm，核衣殼螺旋對(duì)稱。基因組為負(fù)鏈單股RNA，長(zhǎng)度為15 000～16 000 nt。NDV 通過(guò)其表面糖蛋白與含唾液酸的化合物(如神經(jīng)節(jié)苷脂和 Ngc 蛋白受體)結(jié)合攻擊呼吸道上皮細(xì)胞。膜融合是NDV入侵宿主的主要方式，除此之外還有受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用方式、胞膜窖依賴性內(nèi)吞方式[11]。陳嚴(yán)玉[12]通過(guò)分析感染新城疫強(qiáng)、弱毒株后雞巨噬細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行功能分析，證實(shí)了宿主miRNA155參與病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，并且可能參與了TAB2所在的p38MAPK信號(hào)通路，通過(guò)一系列的反應(yīng)影響細(xì)胞的病變現(xiàn)象或者病毒的組裝和出芽。Chen Yu等[13]用NDV感染雞胚成纖維細(xì)胞株DF-1細(xì)胞后，將miRNA模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染到NDV感染的DF-1細(xì)胞中，觀察miRNA在NDV復(fù)制中的作用，結(jié)果表明gga-miR-451和gga-miR-199-5p促進(jìn)了NDV的復(fù)制，而gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p抑制了NDV的復(fù)制，進(jìn)一步的功能研究顯示gga-miR-451可抑制NDV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.3 miRNA與日本乙型腦炎病毒日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)又稱乙腦病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)。病毒顆粒為球狀，直徑約50 nm，有1層結(jié)合牢固的類脂囊膜及不明顯的膜粒，核衣殼可能為20面體對(duì)稱?；蚪M為線狀正鏈單股RNA，長(zhǎng)度為10 600～10 900 nt。JEV感染神經(jīng)元細(xì)胞可顯著上調(diào)宿主miR-let-7f的表達(dá)；當(dāng)JEV感染miR-let-7f過(guò)表達(dá)的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)病毒效價(jià)以及釋放至體液中的病毒顆粒數(shù)會(huì)明顯降低，證明miR-let-7f上調(diào)可抑制JEV復(fù)制[14]。杜加茹等[15]通過(guò)分析感染JEV小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，小鼠原代腦神經(jīng)元細(xì)胞中mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-146a-5p的表達(dá)可促進(jìn)JEV-E基因在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)，而mmu-miR-301a的表達(dá)抑制JEV-E基因的表達(dá)。JEV-E蛋白基因是JEV的毒力蛋白基因。JEV-E蛋白的毒力氨基酸位點(diǎn)突變可以改變JEV的致病性。這些位點(diǎn)通常用作檢測(cè)減毒疫苗質(zhì)量和判斷野毒JEV突變毒力的關(guān)鍵指標(biāo)。呂雯婷[16]以miR-499-5p為研究對(duì)象，通過(guò)增殖培養(yǎng)、TCID50測(cè)定、JEV qRT-PCR等檢測(cè)方法，最終證實(shí)了在乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)及豬腎傳代細(xì)胞(PK-15)中miR-499-5p表達(dá)上調(diào)均可抑制JEV增殖，證明miR-499-5p對(duì)JEV的抑制作用具有普遍性。

2.4 miRNA與禽白血病病毒禽白血病病毒亞型J(Avian leukosis virus-J，ALV-J)，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科(Orthortrovirinae)，甲型逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Alpharetrovirus)。病毒顆粒直徑80～100 nm，有囊膜，具有獨(dú)特的3層結(jié)構(gòu)。最內(nèi)層為基因組核衣殼蛋白復(fù)合物，包含反轉(zhuǎn)錄酶，螺旋對(duì)稱；中間層為20面體衣殼，直徑約60 nm；外層為源于宿主細(xì)胞膜的囊膜?；蚪M為二倍體，由2個(gè)線狀正鏈單股RNA組成，每個(gè)單體長(zhǎng)7 000～11 000 nt，具有3’端聚A尾及5’端帽。Feng W等[17]發(fā)現(xiàn)3個(gè)宿主miR-146a-5p、miR-429-3p、miR-155的靶標(biāo)均參與Wnt通路，通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路導(dǎo)致感染ALV-J的雞生長(zhǎng)遲緩。謝青梅[18]利用miRNA芯片技術(shù)，在感染ALV-J的10周齡雞肝臟中發(fā)現(xiàn)并鑒定出12個(gè)與雞J亞群禽白血病腫瘤形成相關(guān)的重要miRNA，并發(fā)現(xiàn)了gga-miR-375、gga-let-7b/7i、gga-miR-221/222、gga-miR-125b在J亞群禽白血病腫瘤形成過(guò)程中起抑癌基因的作用，而gga-miR-2127、gga-miR-1456、gga-miR-1790則起到致癌基因作用。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，宿主編碼靶向病毒基因的miRNA是在病毒與宿主的相互作用過(guò)程中產(chǎn)生并保留下來(lái)的、可作為宿主抗病毒免疫反應(yīng)的重要抗病毒因子，在病毒感染的早期發(fā)揮重要作用[19]。miRNA對(duì)在病毒感染以及宿主抗病毒感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，對(duì)miRNA的研究越來(lái)越受到重視，同時(shí)也取得了較大進(jìn)展。相信隨著miRNA研究的深入，特別是miRNA相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，miRNA會(huì)成為病毒診斷及療效監(jiān)控中特異性和靈敏度均較高的生物標(biāo)志物。