李碧明 云浮市疾病預(yù)防控制中心（廣東，云浮，527300）

禽流感是指由禽流感病毒引起的一種禽類傳染病，可以引起禽類呼吸器官或全身性感染。根據(jù)病毒的外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，禽流感病毒可分為16個HA亞型和9個NA亞型［1］。目前引起人類感染和發(fā)病的主要為H5、H7和H9這3種亞型，人感染禽流感主要是由于接觸感染病毒的禽鳥及其分泌物和排泄物［2］?；钋萁灰资袌鍪鞘忻窠佑|禽鳥等活禽的主要場所，是人感染H5N1、H7N9等禽源流感的高風(fēng)險區(qū)域［3-4］。云浮市在2017年2月報告首例人感染H7N9本地病例，提示云浮市存在一定的禽流感疫情風(fēng)險。文章對云浮市2016-2018年禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果進行分析，了解云浮市區(qū)的禽流感病毒分布狀況，為人感染禽流感預(yù)防控制工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本采集

根據(jù)《廣東省家禽鳥類市場環(huán)境樣品禽流感病毒污染監(jiān)測方案》要求，在2016-2018年選擇云浮市5個縣市區(qū)的城鄉(xiāng)活禽交易市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場等2類涉禽場所作為外環(huán)境監(jiān)測點，每年11月至次年4月每月采集60份以上標本，其余月份每月采集20份標本，主要采集家禽糞便標本、籠具表面涂抹物、禽類飲水、清洗禽類的污水、宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標本及其他標本（包括不明原因死亡家禽、野禽咽拭子和肛拭子）。采樣液為病毒采樣液（北京友康），24h內(nèi)檢測置于4℃冰箱保存，未能及時檢測則置于－70℃保存。

1.2 檢測方法

在Ⅱ級生物安全柜內(nèi)對標本進行核酸提取，RNA提取采用磁珠法，核酸提取試劑盒為天隆核酸提取試劑盒。提取RNA后，采用實時熒光定量－聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）方法進行甲型流感病毒核酸檢測，對甲型流感病毒核酸陽性的標本進行H5、H7、H9亞型核酸檢測，對H7亞型陽性的標本再進行N9亞型檢測。real-time PCR儀為美國ABI7500 FAST，核酸檢測試劑盒分別為：甲型流感病毒核酸檢測試劑盒、禽流感病毒H5/H7/H9亞型三重核酸檢測試劑盒、甲型流感N9基因檢測試劑盒，均由深圳生科原生產(chǎn)。PCR反應(yīng)體系配制：總體積25μl，包括PCR反應(yīng)液：17μl；引物探針混合液：2μl；混合酶液：1μl。參數(shù)設(shè)置：50℃30min；95℃3min；95℃5s；55℃60s，45個循環(huán)。實驗結(jié)果根據(jù)real-time PCR擴增曲線、Ct值判斷。

1.3 統(tǒng)計方法

將有關(guān)數(shù)據(jù)錄入EXCEL軟件進行整理，通過Graph Pad Prism8.02軟件進行統(tǒng)計分析，陽性率的比較采用One-way A nova，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 禽類市場環(huán)境不同亞型禽流感病毒的陽性率比較

共采集標本1765份，檢出甲型流感病毒核酸陽性標本378份，平均陽性率為21.42%。2016-2018年甲型流感病毒核酸陽性率分別為：14.13%、29.13%、19.83%。各年甲型流感病毒核酸陽性率差別較大，其中2017年甲型流感病毒核酸陽性率最高。3年持續(xù)監(jiān)測禽流感病毒不同亞型的污染狀況，各病毒亞型監(jiān)測情況見表1。病毒亞型陽性率存在顯著性差別，（P<0.0001）其中H9亞型的檢出率明顯高于其他型別，為禽類市場環(huán)境標本禽流感病毒的主要病原體（見圖1）。

圖1 不同亞型禽流感病毒陽性率比較

表1 2016-2018年云浮市禽類市場外環(huán)境標本禽流感病毒監(jiān)測結(jié)果

2.2 禽流感病毒亞型的時間分布

監(jiān)測H5、H7、H9亞型在2016年1月至2018年12月的時間分布顯示，在各監(jiān)測時間點，H9亞型陽性率均高于H5、H7亞型，其中2018年8月達45.00%。在2016年5、7、11、12月、2017年的1-5月和2018年1月檢出H7亞型，進一步的分型顯示均為H7N9亞型，陽性率最高為21.67%。H5亞型檢出率總體上低于H9亞型，高于H7亞型（見圖2）。

圖2 2016-2018年云浮市禽類市場禽流感病毒月監(jiān)測結(jié)果

2.3 不同標本類型的禽流感病毒污染狀況

1765份標本中，清洗禽類的污水標本Flu A陽性率為32.31%（95/294），宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標本Flu A核酸陽性率為32.97%（91/276）；其余4種標本類型Flu A核酸陽性率分別為：糞便14.08%（86/611）；籠具表面擦拭標本19.60%（100/510）；禽類飲水標本4.2%（2/48）；其他標本15.40%（4/26）。6種標本類型陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P值<0.05）。清洗禽類的污水標本和宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標本的Flu A核酸陽性率明顯高于其他標本類型，提示清洗禽類的污水和案板表面是禽流感病毒污染的主要媒介（見圖3）。

圖3 不同類型標本的禽流感病毒核酸陽性率比較

3 討論

對云浮市2016-2018年的禽流感病原監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)云浮市禽類市場外環(huán)境禽流感病毒的陽性率為21.4%，廣東省廣州［1］、珠海［5］、惠州［6］等珠三角地市的外環(huán)境禽流感病毒陽性率均為40%以上。云浮市禽類市場外環(huán)境禽流感病毒污染程度較低，這可能與云浮市縣市區(qū)多為城鄉(xiāng)結(jié)合型城鎮(zhèn)，城區(qū)禽類市場活禽多來自本地，與其他城市活禽交易不活躍有關(guān)。全年均能監(jiān)測到禽流感病毒，提示禽流感病毒廣泛分布于云浮市禽類市場外環(huán)境中，需要加強市場外環(huán)境禽流感病原學(xué)監(jiān)測，分析發(fā)展趨勢變化。

針對禽流感病毒亞型分析發(fā)現(xiàn)，H9亞型的污染比例遠高于其他型別，與珠三角其他地市的研究結(jié)果類似，均提示活禽市場外環(huán)境禽流感病毒污染源主要以H9亞型為主［7-8］。有研究表明，攜帶病毒的禽類是人感染禽流感的主要傳染源［5，9］，外環(huán)境H7N9亞型在2017年1-5月出現(xiàn)流行高峰，提示人群在活禽交易市場感染禽流感病毒的風(fēng)險較高，需加強市場休市、終末消毒等有關(guān)措施落實。云浮市在2017年2月報告首例人感染H7N9本地病例，這可能與外環(huán)境H7N9亞型在2017年1-5月出現(xiàn)流行相關(guān)。采集的6種不同類型的樣本中均檢出禽流感病毒，其中糞便標本、籠具表面擦拭標本病毒檢出率相對較低，與有關(guān)研究結(jié)果［10］一致，可能與禽流感病毒為呼吸道傳播病毒，禽類糞便標本病毒載量較低，且糞便標本不利于禽流感病毒的長期保存有關(guān)［11］。而潮濕的環(huán)境有利于禽流感病毒存活較長的時間［12］，因此，在開展外環(huán)境監(jiān)測時，應(yīng)采集更容易被病毒污染的屠宰用具及污水標本，從而提高監(jiān)測的敏感性。

綜上所述，在云浮市禽類市場進行禽流感病原學(xué)監(jiān)測具有積極意義，可為云浮市人感染禽流感病毒提供預(yù)警和指導(dǎo)有關(guān)控制措施實行。政府部門應(yīng)在冬春季節(jié)來臨前，針對暴露于城鄉(xiāng)活禽市場和家禽屠宰廠、從事活禽宰殺工作的高危人群和鴨類養(yǎng)殖區(qū)域開展重點監(jiān)測和宣傳教育。