陳 峰 唐曉宇 南通海關(guān)綜合技術(shù)中心（江蘇，南通，226005）

隨著“一帶一路”倡議的推進(jìn)，蚊媒傳染病從國(guó)外地區(qū)傳到內(nèi)地的幾率越來(lái)越大。在我國(guó)境內(nèi)產(chǎn)生傳播、在局部地區(qū)形成流行性病例的風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越大，在極大程度上威脅到人類(lèi)健康與社會(huì)發(fā)展。我國(guó)曾自按蚊、庫(kù)蚊與伊蚊內(nèi)提取出很多不同的蟲(chóng)媒病原體，自動(dòng)物與人類(lèi)血清內(nèi)檢出了不同蟲(chóng)媒病原體的抗體，也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)輸入性病例；蚊類(lèi)最強(qiáng)活動(dòng)階段，出現(xiàn)了病毒性腦炎與原因不清的發(fā)熱病例，可見(jiàn)，尚未探明的未知蟲(chóng)媒病原體可能存在于蚊類(lèi)體內(nèi)，為此檢測(cè)水平的提升尤為重要。截止當(dāng)前自蚊類(lèi)體內(nèi)已檢出了將近300種的病原體，就世界各地而言，每年蚊媒傳染病可導(dǎo)致巨大疾病壓力的產(chǎn)生。近年來(lái)，由于科技的飛速發(fā)展，基因編輯技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用蚊媒傳染病研究方面［1］?；蛐揎椫饕扇∫哉婧宿D(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)的ZFN（鋅指核酸內(nèi)切酶）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶2種技術(shù)，但這2項(xiàng)技術(shù)因復(fù)雜的設(shè)計(jì)、較低的效率等缺陷使得其相對(duì)局限，不能實(shí)現(xiàn)廣泛推行［2］。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)始自20世紀(jì)90年代，其在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的首次應(yīng)用是在7年后，隨即于極短時(shí)間內(nèi)成為許多領(lǐng)域（如微生物學(xué)、農(nóng)業(yè)與人類(lèi)生物學(xué)等）應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)基因編輯工具［3］。利用CRISPR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)病毒自身基因向細(xì)菌的整合，借助細(xì)菌的細(xì)胞工具來(lái)服務(wù)于病毒基因復(fù)制，為了有效清除來(lái)自病毒的入侵基因，細(xì)菌完成了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的進(jìn)化，其能夠利用此系統(tǒng)輕易地切除掉侵入自身基因組的病毒基因，此免疫系統(tǒng)只存在于細(xì)菌中［4］。CRISPR技術(shù)通過(guò)基因編輯實(shí)現(xiàn)對(duì)生物DNA序列的添加、修剪、替換、切斷操作，從而改變生物體的某些特性［4］。CRISPR技術(shù)的開(kāi)展為蚊蟲(chóng)生理、生化、發(fā)育、宿主同病原體間的聯(lián)系等多個(gè)方面的基礎(chǔ)性分子生物研究配備了靶標(biāo)特異性的修飾工具，為蚊媒傳染病控制技術(shù)的提升開(kāi)辟出新路徑。

1 CRISPR技術(shù)研究現(xiàn)狀

1.1 CRISPR技術(shù)簡(jiǎn)介

以目前應(yīng)用最廣泛的發(fā)現(xiàn)于化膿型鏈球菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，其由下述3部分構(gòu)成：其一為特異性的CRISPR相關(guān)RNA（即“cr-RNA”）；其二為反式激活的crRNA （即“tracr-RNA”）；其三為CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切9（即“Cas9”）［5］。此外，之后的相關(guān)學(xué)者實(shí)現(xiàn)了內(nèi)含靶向指導(dǎo)序列的crRNA向tracrRNA內(nèi)有效融合，從而建立了單鏈導(dǎo)向RNA（即“sgRNA”），可以代替cr-RNAtracrRNA復(fù)合體，為Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定向切割提供指導(dǎo)［6］。總體來(lái)說(shuō)，CRISPRCas反應(yīng)由下述3個(gè)階段構(gòu)成。（1）第一階段，屬于適應(yīng)階段。此階段，蛋白復(fù)合物Cas1-Cas2切除目的DNA序內(nèi)的Protospacer（原型間隔子），同時(shí)完成此Protospacer向5’末端的CRISPR重復(fù)序列的插入，由此得到1個(gè)新的間隔子［7］；（2）第二階段，屬于表達(dá)與加工階段。此時(shí)，CRISPR序列和前一步驟所得新間隔子聯(lián)合轉(zhuǎn)錄，得到前體crRNA （Precr-RNA），同時(shí)借助特殊的Cas9加工成成熟的crRNA；（3）第三階段，屬于干擾階段。此時(shí)，crRNA結(jié)合Cas9蛋白，得到復(fù)合體，能夠?qū)AM（原型間隔序列毗鄰基序）前的靶點(diǎn)序列進(jìn)行識(shí)別，活化Cas9內(nèi)HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域，從而具備切割作用，借助此功能可以讓DNA雙鏈斷開(kāi)（DSBs），再通過(guò)機(jī)體相關(guān)自我修復(fù)途徑，諸如NHEJ（非同源末端連接）或HDR（同源修復(fù)）等，順利完成基因組的定點(diǎn)插入、敲除或修飾［8］。

1.2 研究現(xiàn)狀

CRISPR所指為內(nèi)含若干短同向重復(fù)的基因座，它的發(fā)現(xiàn)來(lái)源于已經(jīng)被測(cè)序的細(xì)菌基因中。作為原核的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，CRISPR發(fā)揮相應(yīng)作用，可提供針對(duì)入侵的外源核酸的獲得性抗性。外源DNA的短片段（即“間隔區(qū)”）向CRISPR重復(fù)序列內(nèi)的基因組整合，作為CRISPR元件保留過(guò)去暴露的記憶［9］。這些被留作記憶的間隔區(qū)通過(guò)與真核生物內(nèi)RNAi相似的途徑來(lái)識(shí)別與沉默外界遺傳物質(zhì)。Cas蛋白（CRISPR相關(guān)蛋白）是CRISPR系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮關(guān)鍵作用的一類(lèi)蛋白質(zhì)成分。

CRISPR技術(shù)的兩大豪門(mén)實(shí)驗(yàn)室分別開(kāi)發(fā)出了一種工具。張鋒實(shí)驗(yàn)室利用Cas13蛋白的天然RNase活性開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了一種方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的實(shí)驗(yàn)室則利用Cas2a的非特異性ssDNA降解開(kāi)發(fā)出另一種稱(chēng)為DETECTR的方法。

檢測(cè)核酸的時(shí)候，大家都希望特異性和靈敏度越高越好。然而，目前的檢測(cè)方法要么缺乏靈敏度，要么缺乏特異性，要么太貴太復(fù)雜，總之，缺點(diǎn)一大堆。好在，科學(xué)家近日利用Cas9蛋白的變體Cas13和Cas12a開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)單又便宜的平臺(tái)，能夠可靠檢測(cè)低水平的核酸。

SHERLOCK和DETECTR分別利用Cas13和Cas12a對(duì)鄰近ssRNA和ssDNA的切割和降解來(lái)切割和激活報(bào)告基團(tuán)，隨后對(duì)這個(gè)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行測(cè)定，即可確定感興趣的DNA、RNA或突變是否存在。這兩個(gè)系統(tǒng)都證實(shí)了CRISPR在診斷上的潛力。

2 蚊媒傳染病常用檢測(cè)方法與CRISPR技術(shù)對(duì)比分析

2.1 蚊媒傳染病病毒抗體檢測(cè)

采用生物醫(yī)療公司生產(chǎn)的相關(guān)病毒試劑盒檢測(cè)患者急性期血清中的病毒抗體。該試劑采用膠體金法，具體原理為：蚊媒傳染病病毒抗體分別預(yù)先包被在試劑條上，可捕獲蚊媒傳染病病毒抗體，與膠體金復(fù)合物（包含多型蚊媒傳染病病毒異性抗原）結(jié)合后如為陽(yáng)性即可顯色。

抗體檢測(cè)是判斷是否感染蚊媒傳染病的間接證據(jù)。依據(jù)血檢測(cè)的要求，用于血清檢驗(yàn)的樣本比較容易收集，而且在收集過(guò)程中注意規(guī)范就可以得到高質(zhì)量的標(biāo)本，這個(gè)過(guò)程便捷快速，對(duì)檢測(cè)人員來(lái)講也更加安全，不容易被感染。抗體是病人體內(nèi)受到病毒刺激后而產(chǎn)生的物質(zhì)，為是否感染的間接證據(jù)。

2.2 蚊媒傳染病患者血清RNA檢測(cè)

蚊媒傳染病病毒RNA檢查采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法，也被稱(chēng)為核酸檢測(cè)。測(cè)定試劑盒主要選擇熒光定量PCR技術(shù)，首先將蚊媒傳染病病毒（RNA結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)。RNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA原料的作用，完成RNA逆轉(zhuǎn)錄，兩條鏈分開(kāi)，生成包含病毒信息的DNA單鏈結(jié)構(gòu)［10］。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。整個(gè)檢測(cè)的核心就是讓DNA不斷自我復(fù)制，探針與DNA結(jié)合時(shí)，熒光結(jié)構(gòu)被抑制不發(fā)光；然后，DNA在聚合酶的作用下，開(kāi)始自我復(fù)制，熒光結(jié)構(gòu)脫落，開(kāi)始發(fā)光。為了確保能夠探測(cè)出熒光信號(hào)，一般循環(huán)設(shè)定為40次。在不存在病毒的檢測(cè)對(duì)象中，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄不會(huì)產(chǎn)生靶基因的擴(kuò)增，所以檢測(cè)結(jié)果是熒光信號(hào)正常，不會(huì)出現(xiàn)增強(qiáng)的現(xiàn)象。

蚊媒傳染病也存在潛伏期和窗口期，只不過(guò)比較短，人體在感染之后，經(jīng)過(guò)病毒的繁殖以及自身免疫系統(tǒng)的作用，要經(jīng)過(guò)3-7d左右才會(huì)在患者體內(nèi)生產(chǎn)抗體，這樣才會(huì)被檢測(cè)出來(lái)。在蚊媒傳染病病毒侵染患者的時(shí)候，最先在人體內(nèi)存在的是蚊媒傳染病病毒的RNA，利用血清檢測(cè)是無(wú)效的，只能依靠PCR的方法進(jìn)行排查和篩選，在病毒RNA出現(xiàn)之后一段時(shí)間人體才會(huì)產(chǎn)生IgM抗體，這種抗體可以使用間接法進(jìn)行檢測(cè)。目前對(duì)病毒的檢測(cè)都依靠試紙進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的對(duì)象就是抗體，這種方法無(wú)法避免窗口期和潛伏期的風(fēng)險(xiǎn)［11］。因此可以知道常規(guī)性的檢測(cè)手段在檢測(cè)蚊媒傳染病的過(guò)程中容易檢測(cè)失效，這是一個(gè)很大的缺點(diǎn)。而利用逆轉(zhuǎn)錄PCR法進(jìn)行檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地查出病毒核酸是否存在于患者體內(nèi)，并給出可信的診斷結(jié)果，相比于其他方式靈敏度是最高的。

2.3 CRISPR技術(shù)檢測(cè)

CRISPR技術(shù)檢測(cè)是將Cas12a酶和CRISPR RNA（crRNA）結(jié)合，構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體。當(dāng)crRNA與病毒RNA上的特異性序列相結(jié)合之后，能夠激活Cas12a酶［12］。Cas12a酶被激活后，能夠?qū)Ω浇膯捂淩NA分子進(jìn)行切割，研究人員同時(shí)在RNA上添加熒光分子，當(dāng)RNA被切斷后，會(huì)釋放出熒光信號(hào)。此時(shí)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行捕捉，就能檢測(cè)到病毒特異性序列的存在［13］。以前基于這一原理的CRISPR檢測(cè)為了提高檢測(cè)的靈敏度，會(huì)通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)大樣本量。而這款檢測(cè)技術(shù)并不需要RCR擴(kuò)增的過(guò)程，就可以直接定量檢測(cè)樣本中的病毒RNA水平，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。蚊媒傳染病檢測(cè)對(duì)于控制疾病傳播、及早診斷治療具有重要意義。熒光定量PCR由于高靈敏度和特異性成為了蚊媒傳染病檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。由于設(shè)備昂貴、操作繁瑣，熒光定量PCR技術(shù)很難用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。所以，研究人員一直致力于研究如何將CRISPR基因編輯法應(yīng)用于蚊媒傳染病的檢測(cè)中，提高蚊媒傳染病的檢測(cè)時(shí)間［14］。經(jīng)過(guò)多年的研究，目前CRISPR技術(shù)檢測(cè)已經(jīng)成熟并且運(yùn)用廣泛，CRISPR法檢測(cè)過(guò)程易于操作，需求的材料僅僅是提純之后的核酸，檢測(cè)步驟只有簡(jiǎn)單的3個(gè)環(huán)節(jié)，檢測(cè)結(jié)果能夠在1h內(nèi)出來(lái)，十分便捷快速。

3 基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測(cè)存在的問(wèn)題

相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測(cè)技術(shù)具有更高的靈敏度，更好的特異性，而且不依賴(lài)于昂貴裝置以及操作者的專(zhuān)業(yè)性，方便快捷，成本低廉，因此成為生物檢測(cè)領(lǐng)域的耀眼新星。然而，目前所使用的基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測(cè)技術(shù)還存在一些不足，主要體現(xiàn)在以下方面：

3.1 基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測(cè)技術(shù)一般需使用RNA熒光報(bào)告探針，但RNA容易降解，致使可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果［15］。

3.2 DNA或RNA的有效獲取是核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)，簡(jiǎn)便快捷無(wú)需依靠?jī)x器即可有效獲取DNA或RNA，是CRISPR技術(shù)在蚊媒病毒檢測(cè)中即時(shí)應(yīng)用的保障，因此，需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)植物或動(dòng)物組織DNA或RNA的簡(jiǎn)便獲取技術(shù)。

3.3 由于單獨(dú)使用Cas12檢測(cè)的靈敏度偏低，基于CRISPR/Cas12的核酸檢測(cè)技術(shù)一般需要2個(gè)反應(yīng)步驟，第一個(gè)步驟是擴(kuò)增反應(yīng)，第二個(gè)步驟是將擴(kuò)增的樣本加入到包含Cas12蛋白和其他反應(yīng)試劑的試管中進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，這不但增加了檢測(cè)流程的復(fù)雜性，而且樣本在轉(zhuǎn)移步驟中可能被污染。因此，需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，讓擴(kuò)增RNA或DNA的步驟和Cas12蛋白檢測(cè)的化學(xué)反應(yīng)能夠在同一個(gè)試管中進(jìn)行，或挖掘更多新型Cas并建立更為簡(jiǎn)單高效的無(wú)需擴(kuò)增的CRISPR/Cas檢測(cè)方法。

4 展望

基于CRISPR系統(tǒng)的蚊媒病毒檢測(cè)的靈敏性和特異性非常突出，已經(jīng)達(dá)到amol/L甚至zmol/L的范圍，并能檢測(cè)點(diǎn)突變，這必將在核酸測(cè)定方面起到非常關(guān)鍵的作用。對(duì)于檢測(cè)速度，最快的分析至少需要15 min，以后可以通過(guò)鑒定新的Cas蛋白和工程改造已存在的Cas蛋白，以及優(yōu)化信號(hào)放大系統(tǒng)，以進(jìn)一步提高檢測(cè)速度。CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測(cè)技術(shù)使用了無(wú)需核酸提取的病原體檢測(cè)（HUDSON）、等溫?cái)U(kuò)增以及試紙條檢測(cè)，為了檢測(cè)更加便捷，今后應(yīng)發(fā)展一步診斷法，包括病原體核酸釋放、預(yù)擴(kuò)增、CRISPR-Cas誘導(dǎo)反應(yīng)和信號(hào)讀出等。未來(lái)還可以將人工智能（artifificial intelligence，AI）與CRISPR-Cas13診斷測(cè)試相結(jié)合，構(gòu)建一個(gè)快速、準(zhǔn)確和更智能的感染性病原體診斷預(yù)警系統(tǒng)。隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌、古菌和細(xì)菌大病毒中的不斷發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)得以不斷豐富發(fā)展。如CRISPR基因編輯先驅(qū)蛋白Cas9，失去切割活性的變體dCas9也可被固定在石墨烯納米材料上，成為核酸檢測(cè)芯片。Cas phi是新近發(fā)現(xiàn)的具有功能的最小分子量的Cas12類(lèi)蛋白，識(shí)別和切割dsDNA被激活后，同樣具有ssDNA附帶切割活性。因此以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)技術(shù)，必將彌補(bǔ)以PCR為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)的不足，可顯著促進(jìn)諸多領(lǐng)域的發(fā)展，包括食品、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)學(xué)等。