王嘉銘 曾裕 聶永勝 陸金健 楊立峰

（廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣州 510000）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠的研究也獲得了較快的發(fā)展。透明質(zhì)酸是一種天然直鏈多糖，由N－乙酰葡糖胺和葡萄糖酸雙糖單位構(gòu)成的線性多糖，分子量大，具有一定粘彈性特質(zhì)［1］。在GB／T16886.11－2011醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分全身毒性試驗(yàn)（附錄F材料介導(dǎo)熱原信息）中提到：對(duì)新型醫(yī)療器械沒(méi)有必要都進(jìn)行體內(nèi)致熱性試驗(yàn)，但材料如含有引起過(guò)熱原反應(yīng)的新化學(xué)成分或物質(zhì)，則宜進(jìn)行材料介導(dǎo)致熱性評(píng)價(jià)［2］，透明質(zhì)酸鈉類面部注射適用于中至深層真皮注射以糾正皺紋或重建軟組織，作為一種植入人體內(nèi)的新型生物材料［3］，為了盡可能降低產(chǎn)品對(duì)患者的不良反應(yīng)，在熱原試驗(yàn)中對(duì)其開(kāi)展正確的制備方法和注射劑量的研究至關(guān)重要［4］。

1 材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)樣品：注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠；浸提介質(zhì)：0.9%氯化鈉注射液；試驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)新西蘭兔（廣州市白云區(qū)龍歸興科動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)），未產(chǎn)并無(wú)孕，體重1.7kg以上。

1.2 試驗(yàn)方法［5］

取適用新西蘭兔3只測(cè)定其體溫，在測(cè)定正常體溫符合要求后15min以內(nèi)，自耳緣靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂良s38℃的供試品。然后每隔30min測(cè)量1次體溫，共6次。以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度（℃）。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià)

3只兔溫度升高均低于0.6℃（或3只兔體溫升高的總和低于1.3℃），判定該樣品浸提液的熱原檢查符合規(guī)定。

2 不同的制備方法［6］和注射劑量［7］

（1）參照GB16886.12－2017［8］，不規(guī)則產(chǎn)品浸提比例0.2g／mL，加入0.9%氯化鈉注射液在37℃下浸提72h。取該制備條件下的浸提液，按10mL／kg的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）對(duì)（1）中制備的樣品浸提液經(jīng)3000rpm離心10min，用0.45μm 濾膜過(guò)濾作為試驗(yàn)液，按照10mL／kg的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

（3）按照浸提比例0.1g／mL，加入0.9%氯化鈉注射液在37℃下浸提72h。取該制備條件下的浸提液按照1mL／kg的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

（4）對(duì)（3）中制備的浸提液用5μm過(guò)濾器過(guò)濾作為試驗(yàn)液，按照0.2mL／kg的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

（5）對(duì)（3）中制備的浸提液用40μm過(guò)濾器過(guò)濾作為試驗(yàn)液，按照0.2mL／kg的注射劑量進(jìn)行熱原試驗(yàn)。

（6）對(duì)（3）中制備的浸提液用40μm過(guò)濾器過(guò)濾作為試驗(yàn)液，按照10mL／kg的注射劑量進(jìn)行熱原試驗(yàn)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

制樣方法和注射劑量按照（1）、（3）進(jìn)行熱原試驗(yàn)，兔在注射浸提液過(guò)程中反應(yīng)異常，然后死亡。

制樣方法（2）進(jìn)行離心后浸提液變成凝膠狀，無(wú)法注射導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行熱原試驗(yàn)。

制樣方法和注射劑量按照（4）進(jìn)行熱原試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中兔反應(yīng)正常，但體溫升高超過(guò)0.6℃，見(jiàn)表1。

表1 熱原試驗(yàn)結(jié)果（浸提比例：0.1g／ml，37℃72h，5μm過(guò)濾，注射劑量：0.2ml／kg）

制樣方法和注射劑量按照（5）使用40μm的濾膜過(guò)濾后，按0.2mL／kg的注射劑量進(jìn)行熱原試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程兔反應(yīng)正常，三只兔體溫升高均低于0.6℃，且體溫升高總和低于1.3℃，在該試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)樣品浸提液熱原檢查合格，見(jiàn)表2。

表2 熱原試驗(yàn)結(jié)果（浸提比例：0.1g／ml，37℃72h，40μm過(guò)濾，注射劑：0.2ml／kg）

制樣方法和注射劑量按照（5）使用40μm的濾膜過(guò)濾后，按10mL／kg的注射劑量進(jìn)行熱原試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程兔子反應(yīng)正常，試驗(yàn)樣品浸提液熱原檢查合格。見(jiàn)表3。

表3 熱原試驗(yàn)結(jié)果（浸提比例：0.1g／ml，37℃72h，40μm過(guò)濾，注射劑量：10ml／kg）

4 討論

該次熱原試驗(yàn)的探討，源于首次常規(guī)操作熱原試驗(yàn)失敗。按照GB／T16886.12制樣原則，常規(guī)器械樣品制備及注射劑量：0.2g／mL，37℃、72h，10mL／kg，造成了試驗(yàn)的異常，引起動(dòng)物不必要死亡。經(jīng)過(guò)整改后的制備方案使得試驗(yàn)正常進(jìn)行，討論如下。

觀察制備方法（1）后的浸提液，肉眼觀察無(wú)顆粒狀出現(xiàn)，但可發(fā)現(xiàn)溶液粘稠，故有制備方法（2）將樣品浸提液離心，經(jīng)離心后，樣品浸提液出現(xiàn)了凝膠狀（樣品與0.9%氯化鈉注射液融合吸收）無(wú)法注射。這兩種制備的方法說(shuō)明樣品按照0.2g／mL的浸提比例不適合熱原試驗(yàn)操作的進(jìn)行。粘稠的浸提液和凝膠狀的浸提液都可能存在大顆粒透明孔徑物質(zhì)，通過(guò)兔耳緣靜脈入血，造成兔異常反應(yīng)和死亡。

降低浸提比例的制備方法（3），同時(shí)注射劑量由10mL／kg降低為1mL／kg（《GB／T14233.2－2005醫(yī)用輸血、輸液、注射器具檢驗(yàn)方法第二部分生物學(xué)試驗(yàn)方法》的最大注射劑量是10mL／kg）［9］，但實(shí)驗(yàn)依然出現(xiàn)了兔異常反應(yīng)和死亡。說(shuō)明此浸提方法得出的浸提液依然存在肉眼觀察不到的大顆粒浸提物質(zhì)。

對(duì)制備方法（3）用5μm過(guò)濾器過(guò)濾（出現(xiàn)了過(guò)濾器無(wú)法濾下，濾膜破壞），再次降低注射劑量。注射進(jìn)兔體內(nèi)后，兔表現(xiàn)正常，但體溫升高（見(jiàn)表1）。最終的整改制備方法是，加大過(guò)濾器的濾膜孔徑。也借助于生產(chǎn)商的協(xié)助，進(jìn)行了樣品孔徑的測(cè)量（見(jiàn)表4），由圖中可以看出此種注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠顆粒最小孔徑為66.897μm，再因?yàn)椤吨袊?guó)人民共和國(guó)藥典》0102注射劑，注射用濃溶液的規(guī)定：混懸型注射液中原料藥物粒徑應(yīng)控制在15μm以下，含15～20μm（間有個(gè)別20～50μm）者，不應(yīng)超過(guò)10%［10］。最終選擇了40μm過(guò)濾器，取過(guò)濾液注射后，動(dòng)物反應(yīng)正常，體溫正常，3只家兔溫度升高均低于0.6℃，體溫升高總和低于1.3℃（見(jiàn)表2）。

（4）由于上述試驗(yàn)方法采用過(guò)濾和降低注射劑量可以使得試驗(yàn)樣品浸提液熱原檢查合格，但是降低劑量并沒(méi)有辦法充分評(píng)價(jià)產(chǎn)品的安全性［11］，因而根據(jù)GB／T16886中規(guī)定的最大劑量再次進(jìn)行熱原試驗(yàn)，將浸提液通過(guò)40μm的過(guò)濾器后，按照10mL／kg的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)，注射后動(dòng)物反應(yīng)正常，熱原檢驗(yàn)合格（見(jiàn)表3）。

注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠的熱原試驗(yàn)，因其自身的產(chǎn)品特性，導(dǎo)致試驗(yàn)的特殊性，根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典2020版四部（0102注射劑）的試驗(yàn)方法中混懸型注射液中原液藥物粒徑的規(guī)定，借助激光粒度分析儀［12］對(duì)于樣品孔徑的測(cè)量（見(jiàn)表4）可以看出此類注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠粒度最小孔徑為66.897μm，若不進(jìn)行過(guò)濾處理，此粒徑大小超過(guò)了中華人民共和國(guó)藥典2020版四部（0102注射劑）中的注射用濃溶液的最大粒徑規(guī)定，因而經(jīng)討論最初選擇5μm的過(guò)濾器處理樣品浸提液，結(jié)果出現(xiàn)很難濾過(guò)的現(xiàn)象，用注射器推動(dòng)濾下浸提液，導(dǎo)致濾膜破裂。說(shuō)明浸提液內(nèi)依然有大分子顆粒通過(guò)破裂的濾膜進(jìn)入注射液中導(dǎo)致體溫升高。之后采用40μm的過(guò)濾器對(duì)樣品浸提液進(jìn)行過(guò)濾處理，按照GB／T16886中規(guī)定的注射劑量進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)正常，體溫正常。故只要試驗(yàn)樣品注射液的粒徑大小符合注射標(biāo)準(zhǔn)，不需再降低注射劑量來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。雖然標(biāo)準(zhǔn)中浸提液一般不應(yīng)采用過(guò)濾、離心或其他方法來(lái)去除懸浮的粒子［5］，但由于樣品浸提液中的粒徑不符合《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》0102注射劑的要求，也在實(shí)際的試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，因此該產(chǎn)品的樣品浸提液需要經(jīng)過(guò)合適的過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)行熱原注射試驗(yàn)。

表4 激光粒度分布檢測(cè)圖

透明質(zhì)酸鈉類面部注射產(chǎn)品在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用上要求有良好的生物安全性，因此通過(guò)正確處理樣品浸提液進(jìn)行熱原試驗(yàn)可以為此類產(chǎn)品的生物安全性提供一定的依據(jù)。