郝麗芬，房永雨，孫 林，趙俊利，史志丹，詹鶴年，丁海君

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

洋草麥 （alien barley） 是一年生禾本科（Gramineae）作物，又稱二棱大麥［1］（Hordeum distichon）。 洋草麥分蘗性強(qiáng)，莖稈纖細(xì)，莖葉量大，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)飼用大麥品種，耐旱性較強(qiáng)，但存在倒伏率較高的缺點(diǎn)，尤其在雨季，伴隨大風(fēng)天氣，極易造成減產(chǎn)和品質(zhì)損失。

許多研究表明，莖稈強(qiáng)度是植物抗倒伏的關(guān)鍵因素之一，莖稈強(qiáng)度又受到木質(zhì)素含量的影響［2-4］。目前認(rèn)為木質(zhì)素生物合成途徑有苯丙酮酸途徑、莽草酸途徑、木質(zhì)素單體及其聚合物特異途徑等［5-6］。木質(zhì)素的生物合成途徑較多， 并涉及很多關(guān)鍵酶基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［7］，以NADPH 為輔酶的肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是催化木質(zhì)素單體合成的關(guān)鍵限速酶［8-9］。 目前在很多植物中已克隆得到CAD 基因，并進(jìn)行了表達(dá)分析和調(diào)控機(jī)制的研究［10-14］，但在洋草麥中還未見研究報(bào)道。

該研究以前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的洋草麥肉桂醇脫氫酶基因（命名為HdCAD 基因）序列為參考序列，采用RT-PCR 技術(shù)，獲得其CDS 序列并對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。 通過該研究擬為揭示HdCAD 基因序列特性，以及為研究HdCAD 基因及其編碼的HdCAD蛋白的相關(guān)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品洋草麥種子由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院草原研究所牧草種質(zhì)資源室提供。2020 年5 月初播種于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院院內(nèi)試驗(yàn)基地，2020 年7 月中旬， 采集地上部分，迅速裝入塑封袋并置于液氮內(nèi)，用于RNA 的提取。

1.1.2 試驗(yàn)試劑洋草麥總RNA 提取使用PureLinkTMRNA 小提試劑盒（賽默飛）；反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript Ⅳ1st strand cDNA Synthesis Mix（TaRaKa）； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其產(chǎn)物凝膠回收采用TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity、Easy-Pure?PCR Purification Kit（北京全式金）；克隆載體為pEASY R-T1； 大腸桿菌感受態(tài)采用Chemically Competent?Cell（北京全式金）；引物由北京華大六合基因有限公司合成。 測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 洋草麥總RNA 的提取將貯藏于液氮內(nèi)的植株材料取出，置于經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速研磨， 提取方法按照賽默飛PureLinkTMRNA 小提試劑盒說明書。 提取后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%）電泳，檢測(cè)其完整性。

1.2.2 洋草麥cDNA 的合成采用PrimeScript Ⅳ1st strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照說明書進(jìn)行操作，獲得洋草麥cDNA。 反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：總RNA（100 ng/μL） 3 μL，Random 6 mers （50 μmol/L）1 μL，5×PrimeScript 1st strandⅣcDNA Synthesis Mix 4 μL，RNase-free Water 12 μL。 輕柔混勻后：30 ℃溫育10 min、42 ℃溫育10 min，95 ℃滅活1 min，冰上冷卻。取部分PCR 產(chǎn)物用于基因克隆， 剩余PCR 產(chǎn)物保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 洋草麥HdCAD 基因克隆與測(cè)序根據(jù)已有洋草麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，調(diào)取洋草麥HdCAD 基因的CDS 片段，利用Primer premiere 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。PCR 反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s、58 ℃退火10 s、72 ℃延伸1 min，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保 持。 將PCR 產(chǎn) 物 回 收 后， 連 接 到pEASY?-T 克隆載體上， 轉(zhuǎn)化至Trans1-T1，37 ℃條件下，在含Amp+的LB 平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌斑PCR 驗(yàn)證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

表1 洋草麥HdCAD 基因克隆的引物信息

表2 洋草麥HdCAD 基因克隆的PCR 反應(yīng)體系

1.2.4 洋草麥HdCAD 基因和HdCAD 蛋白的生物信息學(xué)分析將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中HdCAD 基因與克隆得到的HdCAD 基因序列進(jìn)行比對(duì)，以克隆測(cè)序的片段為準(zhǔn)。 HdCAD 蛋白的基本理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)域分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析、三級(jí)結(jié)構(gòu)建模、 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建等生物信息學(xué)分析參考房永雨等［15］報(bào)道的方法，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析采用在線預(yù)測(cè)軟件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋草麥HdCAD 基因克隆結(jié)果

洋草麥總RNA 電泳結(jié)果顯示， 提取的總RNA 有28S 和18S 共2 條明亮、清晰的條帶（見圖1），說明提取的RNA 完整，質(zhì)量好，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)試驗(yàn)研究。PCR 產(chǎn)物片段經(jīng)膠回收、轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測(cè)序， 克隆得到的洋草麥Hd-CAD 基因的編碼區(qū)（CDS）為1 071 bp（見圖2），與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比對(duì)后， 相似度為99.5%， 編碼356 個(gè)氨基酸（見圖3）。

圖1 洋草麥總RNA 凝膠電泳圖

圖2 HdCAD 基因克隆結(jié)果

2.2 HdCAD 蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 HdCAD 蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果經(jīng)過Prot Param tool 在線軟件預(yù)測(cè)，HdCAD 蛋白的相對(duì)分子量為87 343.11 Da，等電點(diǎn)（pI）為4.98，分子式為C3013H4957N1071O1240S353，原子總數(shù)為10 634，估計(jì)在酵母菌內(nèi)半衰期大于20 h， 不穩(wěn)定指數(shù)為56.03，屬于穩(wěn)定類型的蛋白，脂肪指數(shù)為16.99，GRAVY 為0.883， 為疏水性蛋白。 分析洋草麥HdCAD 蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示，該蛋白存在9個(gè)絲氨酸（serine）磷酸化位點(diǎn)、6 個(gè)蘇氨酸（threonine）磷酸化位點(diǎn)、2 個(gè)酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點(diǎn)（見圖4）。 洋草麥HdCAD 蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，編碼區(qū)蛋白定位到細(xì)胞質(zhì)中，編碼區(qū)蛋白不含有信號(hào)肽。

2.2.2 HdCAD 蛋白保守結(jié)構(gòu)域以及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果對(duì)HdCAD 蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，含有CAD1 保守結(jié)構(gòu)域，屬于MDR 超家族，其中含有1 個(gè)NAD（P）結(jié)合位點(diǎn)，具有氧化還原酶活性， 此外還含有3 個(gè)催化鋅結(jié)合位點(diǎn)和4 個(gè)底物鋅結(jié)合位點(diǎn)（見圖5）。分析編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白的CDS 區(qū)無規(guī)則卷曲含有160 個(gè)氨 基 酸 （44.94%），α 螺 旋 含 有80 個(gè) 氨 基 酸（22.47%），延伸鏈含有90 個(gè)氨基酸（25.28%），β轉(zhuǎn)角含有26 個(gè)氨基酸 （7.30%）（見圖6）。 利用SWISS-MODEL 構(gòu)建基因的CDS 區(qū)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，以高粱肉桂醇脫氫酶蛋白質(zhì)（SMTL ID：5 vkt.1） 為三維結(jié)構(gòu)模板， 預(yù)測(cè)HdCAD 蛋白的空間結(jié)構(gòu)，兩者一致性達(dá)到79.8%，其結(jié)構(gòu)模型為橢球形（見圖7）。

2.2.3 HdCAD 蛋白序列的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析在NCBI 網(wǎng)站中，利用Blastp 程序?qū)dCAD 蛋白序列進(jìn)行檢索， 從NCBI 網(wǎng)站下載HdCAD 蛋白的同源序列，結(jié)果表明，其與二粒小麥TtCAD（accession number：XP_037434468.1）、節(jié)節(jié)麥AtCAD（accession number：XP_020159838.1）、西 藏 裸 大 麥 HvCAD （accession number：KAE8784648.1）、 烏拉爾圖小麥TuCAD（accession number：EMS68862.1）的蛋白相似度最高，均大于90%，分別為96.35%、95.79%、94.94%、96.66%；與二 穗 短 柄 草 BdCAD （accession number：XP_003576507.2）、黑麥草LpCAD（accession number：XP_003576507.2）、彎葉畫眉草EcCAD（accession number：TVU09473.1） 的蛋白相似性均大于80%， 分別為84.31%、82.87%、80.74%。 利用DNAMAN 軟件將洋草麥HdCAD 蛋白與其他同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示HdCAD 蛋白含有多個(gè)保守序列（見圖8）。 利用MEGA 7 軟件的CLUSTER W 進(jìn)行同源序列比對(duì)，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示， 洋草麥HdCAD 蛋白與二粒小麥親緣關(guān)系最近，其次是節(jié)節(jié)麥、西藏裸大麥；與擬南芥、煙草的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與多重比對(duì)結(jié)果一致（見圖9）。

圖3 HdCAD 基因克隆序列與轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)圖

圖4 HdCAD 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖5 HdCAD 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖6 HdCAD 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖7 HdCAD 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖8 HdCAD 蛋白與其他植物CAD 氨基酸序列的多重序列比對(duì)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

肉桂醇脫氫酶基因（CAD）是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因之一， 該研究在二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR 技術(shù)，克隆洋草麥肉桂醇脫氫酶基因（HdCAD）的CDS 序列，大小為1 071 bp，編碼356 個(gè)氨基酸。 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，目前獲得和預(yù)測(cè)的植物CAD 基因CDS序列的長(zhǎng)度在978～1 104 bp［16-17］。其同源氨基酸比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除C 端靠前的序列差異較大外，其在進(jìn)化上還存在一定的保守性［7］。

通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)HdCAD 蛋白共有17 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。 該蛋白為不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽位點(diǎn)，預(yù)測(cè)定位到細(xì)胞質(zhì)中，不屬于膜蛋白或分泌蛋白， 這與大多克隆到的CAD 基因結(jié)果相同［18-19］。 在洋草麥HdCAD 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲是主要結(jié)構(gòu)元件，其次是延伸鏈、α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)元件，這與非洲菊［11］、蜜柚［13］、蠟梅［18］、巨龍竹［20］等植物相同，都是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最大。洋草麥HdCAD 蛋白含有多個(gè)催化鋅結(jié)合位點(diǎn)和底物鋅結(jié)合位點(diǎn)，具有典型的CAD1 結(jié)構(gòu)域。 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，HdCAD 蛋白與二粒小麥、節(jié)節(jié)麥、西藏裸大麥親緣關(guān)系最近，這也從分子層面上揭示，該品種的培育可能來源于大麥、小麥或者山羊草屬植物。

圖9 不同植物CAD 蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

隨著退牧還草制度的實(shí)施， 人工建植牧草品種的需求越來越大， 洋草麥作為一種優(yōu)良的飼用牧草，可以在人工建植草地中發(fā)揮一定作用。該研究首次獲得了洋草麥的HdCAD 基因，為下一步研究洋草麥抗非生物脅迫的功能提供參考。