趙霏霏，楊 丹，辛雅明，楊銀鳳

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010018）

傳代細(xì)胞系是開展基礎(chǔ)研究和動(dòng)物病毒研究的基礎(chǔ)， 許多與動(dòng)物病毒相關(guān)的研究由于缺乏特定種屬的穩(wěn)定細(xì)胞系受限制， 綿羊源的細(xì)胞系尤其缺乏， 嚴(yán)重阻礙了綿羊病毒的生物學(xué)研究和疫苗的開發(fā)。 成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最主要的細(xì)胞，在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，體外培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)成本低，遺傳信息穩(wěn)定［1］。 但正常的原代細(xì)胞經(jīng)過多次分裂會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞衰老的現(xiàn)象［2］，因此，需要建立生理狀態(tài)正常并且可以長(zhǎng)期傳代的永生化細(xì)胞系用于試驗(yàn)研究。 目前已知能使細(xì)胞永生化的方法有很多種， 常用的方法有將SV40、HPV、EB 等病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 建立永生化細(xì)胞系［3］，此外，還可以將原癌基因?qū)爰?xì)胞或利用放射性因素、 化學(xué)藥物的刺激建立永生化細(xì)胞系， 這些方法建立的細(xì)胞系往往會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變、 核型改變或失去接觸性抑制， 成為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 近年來報(bào)道最多的是將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）轉(zhuǎn)入細(xì)胞使其永生化，hTERT 永生化細(xì)胞具有原代細(xì)胞的原始特性及傳代細(xì)胞無(wú)限增殖的能力［4］。

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由一段特殊的DNA 重復(fù)序列和相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，可保護(hù)DNA 不被降解［5］。 正常體細(xì)胞隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加端粒逐漸縮短， 端?？s短到一定程度時(shí)細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖， 激活端粒酶可延長(zhǎng)端粒。 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 （telomerase reverse transcriptase，TERT）能激活端粒酶、延長(zhǎng)端粒，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞永生化［6］。 目前將hTERT 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞基因組建立的永生化細(xì)胞系有山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系［7］、豬小腸上皮細(xì)胞系［8］、人軟骨細(xì)胞［9］、牛 乳 腺 上 皮 細(xì) 胞 系［10］、綿 羊 附 睪 上 皮 細(xì) 胞系［11］等多種永生化細(xì)胞系，但未見永生化綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞系的報(bào)道。

該試驗(yàn)通過PEI 介導(dǎo)pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞建立永生化綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞系， 旨在為綿羊源病毒致病機(jī)理和疫苗的研究提供體外永生化細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取屠宰場(chǎng)健康的綿羊瘤胃組織。

1.2 主要儀器及試劑

CO2培養(yǎng)箱（Thermo）、顯微成像系統(tǒng)（CKX41，Olympus）、蔡司共聚焦顯微鏡（LSM 800，Zeiss）、多功能酶標(biāo)儀（SynergyTMH4，BioTek）、基礎(chǔ)電泳儀電源（Bio-Rad）、小型轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad）、垂直電泳儀（Bio-Rad）、細(xì)胞凍存盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、總RNA 提取試劑盒 （Axygen Scientific）、Premix TaqTM（TaKaRa）、DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液（北京索萊寶科技有限公司）、G418 （北京索萊寶科技有限公司）、Anti-Telomerase reverse transcriptase 抗體 ［Y182］（Abcam）、HRP-conjugated anti-rabbit secondary （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)劉淑英教授惠贈(zèng)； 其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.3 綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞（ORFCs）的分離培養(yǎng)

原代綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞采用組織塊貼壁法培養(yǎng)： 將新鮮的瘤胃組織用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，置于含5 倍雙抗、5 倍慶大霉素、5 倍兩性霉素B 的PBS 中浸泡1 h； 將組織帶入超凈工作臺(tái)，剪成1 mm3大小的組織塊，放入50 mL 離心管，加入組織塊兩倍體積的胰蛋白酶，放入37 ℃溫箱消化30 min（隔10 min 搖晃1 次離心管，使胰蛋白酶與組織塊充分混合），用200 目細(xì)胞篩分離消化液與組織； 將組織塊均勻鋪在25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部， 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶倒置后加入4 mL 完全培養(yǎng)基（含10%FBS、1%PS 的DMEM/F12），倒置細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37 ℃、5%CO2、 飽和濕度為40%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h；4 h 后翻轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 繼續(xù)培養(yǎng)。 待ORFCs 從貼壁的組織塊中爬出并生長(zhǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上進(jìn)行ORFCs 的傳代培養(yǎng)。

1.4 G418 最佳篩選濃度的確定

將綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 加入1 mL 含有不同濃度G418 的篩選培養(yǎng)基 （G418 濃度為100～1 100 μg/mL， 共11 個(gè)梯度），同時(shí)設(shè)1 個(gè)陰性對(duì)照（不加G418），每個(gè)梯度設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。 2 周后在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，能殺死所有細(xì)胞的最低G418 濃度即為最佳篩選濃度，確定G418 最佳篩選濃度為500 μg/mL。

1.5 綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞接種于6 孔板中，用含10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待瓶底細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑PEI 介導(dǎo)pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。 48 h 后棄掉原培養(yǎng)基，用含有最佳篩選濃度的G418 篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，將篩選培養(yǎng)基的G418 濃度減半，繼續(xù)培養(yǎng)；直到出現(xiàn)陽(yáng)性克隆細(xì)胞， 用紙片消化法分離陽(yáng)性克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)， 篩選出來的陽(yáng)性克隆細(xì)胞命名為hTERTOvine Ruminal Fibroblasts Cells （hTERT-ORFCs）。

1.6 ORFCs 和hTERT-ORFCs 生長(zhǎng)曲線的繪制

將培養(yǎng)到第3 代（F3）的原代ORFCs 和第35代（F35）的hTERT-ORFCs 棄掉培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 遍后， 將貼壁生長(zhǎng)的ORFCs 用胰酶消化下來。 調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，以每孔1×104個(gè)的量分別接種于24 孔板。 放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后開始細(xì)胞計(jì)數(shù)，每24 h 利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)， 每次對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的3 孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3 孔細(xì)胞的平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)7 d。 根據(jù)7 d 的計(jì)數(shù)結(jié)果， 利用Graphpad Prism 7.0 軟件，以天數(shù)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 hTERT-ORFCs 外源hTERT 基因的檢測(cè)

按照總RNA 提取試劑盒（Axygen）的說明書同 時(shí) 提 取Hela、ORFCs 和hTERT-ORFCs 的 總RNA；按照去基因組DNA 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaRa-Ka）的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 得到的cDNA 于-20 ℃條件保存?zhèn)溆谩?以上述cDNA 為模板，參考劉騰等［12］的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物（見表1），PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)，進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

表1 目的基因大小及引物序列

1.8 hTERT-ORFCs hTERT 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的動(dòng)物細(xì)胞全蛋白提取試劑盒提取hTERT-ORFCs 第15 代（F15）、第35 代（F35）的細(xì)胞全蛋白，同時(shí)提取HeLa 和ORFCs 細(xì)胞的全蛋白分別作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照， 采用Western Blot 方法檢測(cè)hTERT 蛋白表達(dá)的情況。

2 結(jié)果

2.1 原代ORFCs 的分離培養(yǎng)結(jié)果

原代ORFCs 分離培養(yǎng)結(jié)果如圖1 所示。 原代ORFCs 培養(yǎng)3 d， 可見ORFCs 均勻地從組織塊四周爬出，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)為梭形，呈放射狀生長(zhǎng)， 細(xì)胞核呈卵圓形 （見圖1A）。 原代ORFCs 培養(yǎng)5 d，細(xì)胞大面積生長(zhǎng)且均勻分布（見圖1B）。 原代ORFCs 培養(yǎng)6 d，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%以上，貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)細(xì)胞老化現(xiàn)象（見圖1C）。

圖1 原代ORFCs 分離培養(yǎng)結(jié)果

2.2 G418 篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞

將培養(yǎng)好的F3代ORFCs 接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%后，轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT 質(zhì)粒。48 h 后用500 μg/mL 的G418 篩選培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞， 篩選結(jié)果如圖2 所示。 篩選第2 天，未成功轉(zhuǎn)染pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒的細(xì)胞大量死亡（見圖2A）。在G418 的篩選下，篩選出較耐受ORFCs（見圖2B、圖2C）。 當(dāng)對(duì)照組ORFCs （未轉(zhuǎn)染pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒的ORFCs）全部死亡后，將G418 選擇培養(yǎng)基的G418 含量減半維持篩選，陽(yáng)性克隆細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞匯合度逐漸增大（見圖2D、圖2E）。 篩選14 d 后，出現(xiàn)大片生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆細(xì)胞（見圖2F），此時(shí)用紙片法分離并擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 ORFCs 陽(yáng)性克隆篩選結(jié)果

2.3 ORFCs 和hTERT-ORFCs 生長(zhǎng)曲線

F3代ORFCs 和F35代hTERT-ORFCs 的 生 長(zhǎng)曲線如圖3 所示，hTERT-ORFCs 在第2 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，ORFCs 在第4 天進(jìn)入平臺(tái)期，hTERTORFCs 在 第5 天 進(jìn) 入 平 臺(tái) 期。 相 比ORFCs，hTERT-ORFCs 生長(zhǎng)更活躍，細(xì)胞對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，增殖能力更強(qiáng)。

圖3 ORFCs 和hTERT-ORFCs 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4 hTERT-ORFCs 與ORFCs 的細(xì)胞形態(tài)

將pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ORFCs， 經(jīng)過G418 篩選后的陽(yáng)性克隆細(xì)胞與原代細(xì)胞相比，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，為長(zhǎng)梭形，具有典型的成纖維細(xì)胞特征，如圖4 所示。

2.5 hTERT-ORFCs 外源hTERT 基因的檢測(cè)

通過RT-PCR 方法檢測(cè)hTERT-ORFCs 外源hTERT 基因的表達(dá)情況， 試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，Hela 細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染的ORFCs 為陰性對(duì)照，Hela 細(xì)胞、F15代和F35代hTERT-ORFCs 在214 bp 處有清晰的單一的特異性條帶， 條帶大小與目的片段大小相符， 說明hTERT 基因成功在ORFCs 中表達(dá)。

2.6 hTERT-ORFCs hTERT 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

利用生工生物工程（上海）股份有限公司的動(dòng)物細(xì)胞全蛋白提取試劑盒， 提取hTERT-ORFCs蛋白。 提出蛋白后利用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和酶標(biāo)儀測(cè)算在562 nm 處的蛋白OD 值。 以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，OD 值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的蛋白的濃度，從而確定上樣量。Hela 細(xì)胞設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，ORFCs設(shè)為陰性對(duì)照，F(xiàn)15代和F35代hTERT-ORFCs 為試驗(yàn)組，進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可知， 以人源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶作為一抗，βacting 作為內(nèi)參蛋白，F(xiàn)15代和F35代hTERT-ORFCs 的目的蛋白均有表達(dá)。

3 討論

成纖維細(xì)胞自身的生物學(xué)特性是可以多向分化、持續(xù)增殖，可以分化為多種細(xì)胞，在傷口修復(fù)、骨折痊愈和膠原細(xì)胞的再生等方面具有重要作用［13］。此外，在保護(hù)珍稀野生動(dòng)物種質(zhì)資源方面也有廣闊的前景， 另一方面成纖維細(xì)胞也是常用的研究機(jī)體功能和疾病的重要種子細(xì)胞。

正常的體細(xì)胞在體外培養(yǎng)分裂一定的次數(shù)后，進(jìn)入衰老期，逐漸停止分裂。 細(xì)胞的永生化是指細(xì)胞經(jīng)過自身或受外界條件刺激而逃避了增殖衰老乃至凋亡，從而具有了無(wú)限增殖的能力。細(xì)胞永生化的常用的方法有慢病毒感染法、 端粒酶法等。采用病毒感染法建立的永生化細(xì)胞系，往往會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞核型發(fā)生變化、具有致瘤性等問題。 而TERT 介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系是正常細(xì)胞，具有正常的核型、正常的生長(zhǎng)速率［14］。 利用細(xì)胞內(nèi)hTERT 基因的過表達(dá)建立的細(xì)胞系既具有原代細(xì)胞的性狀又具有連續(xù)培養(yǎng)的特性， 具有良好的應(yīng)用價(jià)值。F15代和F35代hTERT-ORFCs 的hTERT 基因和蛋白表達(dá)結(jié)果表明，成功將hTERT基因穩(wěn)定地整合到了hTERT-ORFCs 的基因組中， 并能表達(dá)相應(yīng)蛋白。 顯微鏡下對(duì)比hTERTORFCs 與ORFCs 細(xì)胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，hTERT-ORFCs 未發(fā)生明顯改變， 通過分析ORFCs 和hTERT-ORFCs 的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)hTERT-ORFCs的增殖能力明顯高于ORFCs。

圖4 ORFCs 和hTERT-ORFCs 細(xì)胞形態(tài)

圖5 目的基因hTERT 的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖6 Western Blot 檢測(cè)hTERT-ORFCs 中的hTERT 蛋白

該試驗(yàn)采用pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ORFCs，得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞。 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、RT-PCR和Western Blot 的結(jié)果顯示， 外源基因hTERT 在ORFCs 穩(wěn)定表達(dá)并且細(xì)胞增殖活力明顯增加。 該試驗(yàn)成功建立了永生化綿羊瘤胃成纖維細(xì)胞系，減少了每次試驗(yàn)需培養(yǎng)原代ORFCs 的時(shí)間和成本，為需要以O(shè)RFCs 作為基礎(chǔ)細(xì)胞系和重要組織工程優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞的各項(xiàng)試驗(yàn)研究提供便利。