李上云 王晨 宣旭嫻 任艷華 房經(jīng)貴

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095）

葡萄是世界上重要的栽培果樹之一［1-2］。葡萄栽培品種隨市場需求不斷變化，市場對葡萄品種多樣化的要求日漸增強，因而品種選育成為葡萄研究的一項極為重要的工作。雜交育種一直以來是葡萄育種的主要途徑，但雜交種子的萌發(fā)率低卻是影響雜交育種效率的關(guān)鍵因素。研究表明，休眠是種子萌發(fā)所需條件的一個關(guān)鍵因子［3-4］，但往往因休眠特性復(fù)雜、萌發(fā)率低，導(dǎo)致種子成苗效率低下，嚴(yán)重影響新品種選育效率。葡萄作為世界上最古老的果樹樹種之一，因其分布范圍廣，生長環(huán)境變化大，種子形成了明顯的休眠特性［5］，即在一定時間內(nèi)，具有生活力的種子在適宜的環(huán)境條件下不能完成萌發(fā)。對于葡萄育種而言，一方面，若種子休眠期短、萌芽整齊一致、發(fā)芽迅速、成苗快和成苗效率高，則育種效率高；另一方面，若休眠時間較長且不同種群差異大和種子萌發(fā)率低，特別是雜交后代種子成苗質(zhì)量差，則會成為制約葡萄育種效率提高的嚴(yán)重問題［6-7］。

近年來，對葡萄種子休眠及其調(diào)控的研究已取得了一定的進展［8-9］，多集中于葡萄種子類型、休眠形成機制、休眠調(diào)控和促進萌發(fā)等方面，但各研究之間的關(guān)聯(lián)度較差，知識點較為分散，休眠機制尚不明晰，未能形成合理的理論體系。目前，因為葡萄不同群體間休眠差異較大，后代種子所體現(xiàn)的休眠程度不一，調(diào)控機制無系統(tǒng)報道，加之種子萌發(fā)率低，導(dǎo)致成苗質(zhì)量差，技術(shù)體系也難以形成，嚴(yán)重影響了葡萄育種效率。為促進種子休眠及萌發(fā)研究的發(fā)展，本文對上述研究內(nèi)容進行梳理綜述，以期形成葡萄種子休眠的系統(tǒng)架構(gòu)，為深入研究休眠機制和解決種子休眠與萌發(fā)的問題提供理論依據(jù)，同時也為種子休眠與萌發(fā)機制的研究指明方向。

1 休眠類型

種子休眠形成不僅受自身遺傳物質(zhì)的控制，也受發(fā)育過程中環(huán)境的影響。休眠類型研究一般從“空間”和“時間”兩方面出發(fā)［6］?！翱臻g”上將種子休眠分為種殼休眠（物理休眠、化學(xué)休眠和機械休眠）、胚休眠（形態(tài)休眠和生理休眠）和復(fù)合型休眠；“時間上”將種子休眠分為先天性休眠、二次休眠和無休眠；基于Nikolaeva［10］提出的生理學(xué)休眠類型，Baskin等［11］把種子休眠分為5類（即5類休眠法）：生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和復(fù)合休眠，后者在生態(tài)學(xué)上使用較為廣泛。在Baskin［11］提出的休眠歸類理論的基礎(chǔ)上，Linkies等［12］研究認(rèn)為，大多數(shù)核心真雙子葉植物基本屬于生理休眠。在葡萄胚休眠過程中，誘導(dǎo)種子胚休眠的不是胚自身，而是胚外圍組織或器官（果肉、種皮和胚乳等）；甘陽英等［9］對不同種源的葡萄種子休眠及萌發(fā)特性研究中得到葡萄種子休眠屬于生理休眠，確定種子休眠是由胚外圍組織導(dǎo)致，且不同種群休眠程度不一（休眠程度：東亞種＜?xì)W亞種＜?xì)W美雜交種＜美洲種），由此可明確葡萄種子休眠類型（圖1），為調(diào)控葡萄種子休眠解除和萌發(fā)提供理論依據(jù)。

圖1 種子（葡萄種子）休眠歸類Fig.1 Dormancy classification of seeds (grape seeds)

2 休眠機制假說

葡萄種子的休眠機制一直是葡萄研究的一個重要方向，因其形成較為復(fù)雜，盡管已在分子生物學(xué)方面有了較深入的研究，但到目前為止，也未能解釋其核心問題。有學(xué)者指出，種子能否萌發(fā)成苗，是胚的生長沖力與種殼或其他外圍組織的阻力此消彼長的結(jié)果［6，13］。因此，葡萄種子休眠機制的研究中，本質(zhì)是探究如何提高胚生長沖力或降低外圍組織阻力，推斷二者何為種子成苗的主因。圍繞這一核心，國內(nèi)外眾多學(xué)者主要將種子休眠機制的假說分為2大類，即形成激素理論和氧化理論（圖2）。

2.1 激素理論

圖2 種子休眠形成機制Fig.2 Formation mechanism of seed dormancy

1964年ABA從植物體中被分離出來，后有研究者發(fā)現(xiàn)其就是致使種子休眠的內(nèi)含發(fā)芽抑制物［6］。Amen［14］考慮到赤霉素（gibberellin，GA）具有促進發(fā)芽的作用，于1968年提出激素平衡理論，認(rèn)為GA誘導(dǎo)產(chǎn)生各種水解酶的作用會被具有抑制能力的激素消解，從而抑制種子發(fā)芽，使其表現(xiàn)出休眠狀態(tài)；當(dāng)GA作用強于抑制物時，種子可正常發(fā)芽。

1975年，基于前述理論，Khan［15］認(rèn)為種子內(nèi)各種激素分工平衡，提出新平衡理論，但未能解釋為何外源添加GA與細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK），仍有大部分種子無法發(fā)芽的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，植物突變體的出現(xiàn)，使激素理論取得較大進步。Karssen等［16］學(xué)者根據(jù)一系列研究，提出種子休眠的激素分工理論（遙控理論），其表明種子休眠與脫落酸 （abscisic acid，ABA）有關(guān)，GA與種子能否發(fā)芽相關(guān)聯(lián)；雖然該理論一定程度上豐富的激素平衡理論，但是仍未能解決休眠性如何維持的問題?；诖死碚?，研究人員利用突變體進一步開展了種子休眠基因的調(diào)控研究［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)種子休眠的解除可能與ABA與GA的互作有關(guān)。Bill［19］研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以調(diào)控GA的代謝及其信號傳導(dǎo)，反之亦可。Linkies等［12］認(rèn)為種子的休眠可能與乙稀、茉莉酸鹽等激素有關(guān)。另外，近年來大多數(shù)研究表明：通過外界條件（光、溫度和水分等）調(diào)控GA、ABA相關(guān)基因，以此調(diào)節(jié)種子休眠。雖然，GA促進種子發(fā)芽的具體機制仍不清晰，但ABA等激素具有抑制葡萄種子發(fā)芽、促進休眠的作用已明確［20-24］。這一結(jié)論進一步輔證了激素理論，為激素調(diào)控葡萄種子休眠提供了理論依據(jù)。

2.2 氧化理論

Roberts［25］通過一系列稻粒發(fā)芽的研究指出，種殼是導(dǎo)致休眠的重要因素，通過排除法推理得出稻殼阻礙種子吸收氧氣，而氧氣對種子發(fā)芽的影響較大，同時提出若糖酵解作用（TCA循環(huán)）在氧氣充足的前提下，N3-、CN-等呼吸抑制劑處理種子，理論上可延遲種子發(fā)芽。盡管如此，但該推論仍無法解釋某些現(xiàn)象，因此通過大量研究之后，1969年Roberts［26］第一次提出戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）假說，認(rèn)為種子發(fā)芽與否，取決于PP途徑運行狀況，并解釋了氧氣與促進休眠種子發(fā)芽的關(guān)系。該假說明確了種子發(fā)芽初期細(xì)胞的需求與PP途徑的相關(guān)性，且兩種途徑都存在于一般生物系統(tǒng)之中，C6/C1在0-1之間。PPP假說雖指出PP途徑是種子發(fā)芽的前提條件，但對于PP途徑為何無法在休眠種子中進行尚未有明確的解釋。

基于Roberts［27］提出得呼吸抑制劑或硝酸根調(diào)控種子休眠的論斷研究，另一些研究者［28-29］得出的發(fā)現(xiàn)休眠種子一般呼吸作用較強，吸收氧的能力強于PP途徑。郭華仁等［6］研究發(fā)現(xiàn)，呼吸抑制劑可促進發(fā)芽是由于此類藥劑破壞了種殼的氧化酶活性，使氧氣易于被種子吸收。近年來，一些新的相關(guān)研究指出，活性氧化物（H2O2、HCLO和HO等）作為氧代謝產(chǎn)物，在信息傳遞及體內(nèi)平衡上至關(guān)重要，且可能通過激素對后熟種子休眠或發(fā)芽進行調(diào)控。Nambara［30］研究也發(fā)現(xiàn)，種子中氧含量的多少，影響種子發(fā)芽抑制物（ABA）含量，從而影響種子休眠與發(fā)芽。

種子休眠性很大程度表現(xiàn)在胚、胚乳及種殼上，其形成受遺傳所控制。近年來，從分子生物學(xué)角度研究休眠，成效較佳［28，30-33］，一般分為成熟調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、休眠解除和表現(xiàn)遺傳等（圖3）。在水稻等作物上發(fā)現(xiàn)PYR/PYL/RCAR基因與ABA受體相關(guān)，ABA敏感度與ABI1與ABI2關(guān)聯(lián)［34］。另有研究表明，脫氧酶NCED基因是大多數(shù)植物的ABA合成所需的，若發(fā)生突變，ABA則無法合成，后熟種子休眠性降低。

眾多研究表明，葡萄種子作為后熟種子，其休眠機制基本符合激素理論和氧化理論，二者雖尚未完全解釋葡萄種子休眠機制，但二者之間相互聯(lián)系，為闡明種子代謝作用以及種子休眠機制提供了重要理論依據(jù)，同時也為解除葡萄種子休眠提供了重要參考。

圖3 種子休眠部分相關(guān)基因（擬南芥、水稻）Fig.3 Some genes related to seed dormancy (Arabidopsis thaliana and rice)

3 休眠與萌發(fā)的調(diào)控

種子休眠是植物長期演化獲得的環(huán)境適應(yīng)性，休眠特性與其地理起源和分布地的環(huán)境條件有關(guān)［36-37］。葡萄種子的休眠與萌發(fā)調(diào)控主要依據(jù)激素理論和氧化理論，圍繞如何降低種子內(nèi)生長抑制劑含量與增加種子內(nèi)生長物質(zhì)含量和減少種殼（外圍組織）阻力與提高胚內(nèi)氧氣含量等問題進行探究。為找到快速解除葡萄種子休眠和提高種子萌發(fā)的方法，前人開展了大量研究，盡管取得了一定進展，但尚未開展系統(tǒng)綜述，且未找到高效調(diào)控的技術(shù)。為此，基于前人研究，并對其進行系統(tǒng)地歸納總結(jié)，繪制出種子休眠機制形成基本調(diào)控圖（圖4），以期為研究葡萄種子高效破眠與萌發(fā)技術(shù)提供經(jīng)驗和理論參考。

3.1 物理調(diào)控

3.1.1 溫度與層積處理 通過調(diào)控溫度，將種子層積處理，是打破種子休眠的主要方法。按溫度范圍及變化，可以分為低溫層積（冷層積）、常溫層積（暖層積）、變溫層積。甘陽英等［9］為探究葡萄種子休眠與解除的規(guī)律，利用3個不同分布中心的種群及其雜交種的20個品種，研究冷層積、常溫層積、變溫層積等方法打破葡萄種子休眠的效果，發(fā)現(xiàn)暖層積打破葡萄休眠種子效果不佳，冷層積（4-5℃）和變溫層積［即20℃（14 h）/10℃（10 h）和30℃（14 h）/20℃（10 h）］2個月可以有效打破歐亞種、東亞種及其雜交種（歐山雜種）的休眠；但對于打破美洲種及歐美種的休眠，變溫層積和暖層積皆無效果，冷層積時間延長至5個月及以上可打破休眠，因此，打破葡萄種子休眠的研究主要集中在用冷層積方面。

通過模擬自然條件打破種子休眠的研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積法可以軟化種皮、增強透性、降低脂類物質(zhì)等抑制劑的含量、增加赤霉素的含量等，從而可以達到誘導(dǎo)休眠種子萌發(fā)的目的［31］。崛內(nèi)昭作作等［37］研究發(fā)現(xiàn)，胚的休眠與果實成熟期相關(guān)，對于完熟的葡萄種子，5℃層積3個月可以打破休眠；于桉［38］利用不同方法處理山葡萄種子，冷層積處理4個月，發(fā)芽率可達61.4%，高于其他處理；甘陽英等［5］研究總結(jié)出葡萄屬不同種群種子休眠程度深淺的規(guī)律，即：歐山雜種＜?xì)W亞種＜?xì)W美雜種＜美洲種，且雜種的休眠程度淺于其親本；林玲、李偉東和Heo等［39-41］發(fā)現(xiàn)，冷層積對打破不同倍性葡萄種子的休眠效果存在差異，四倍體葡萄萌發(fā)率低于二倍體葡萄；羅堯幸等［42］得出冷層積4個月后，不同品種葡萄種子萌發(fā)率不同，“北冰紅”萌發(fā)率（89.5%）最高，“赤霞珠”（50.0%）最低。

圖4 葡萄種子休眠與萌發(fā)基本調(diào)控Fig.4 Basic regulation of grape seed dormancy and germination

上述研究表明，低溫層積處理可在一定程度上打破葡萄種子休眠，但對打破不同倍性及不同種群的葡萄種子的休眠程度存在差異。因此，研究層積處理與打破不同種群葡萄種子的休眠之間的關(guān)系，對葡萄雜交種子休眠解除與萌發(fā)具有重要意義。

3.1.2 機械處理 葡萄種子休眠是由于胚休眠導(dǎo)致，種殼及其外圍組織致使其透性不良是引起休眠的其中一個原因，因此可通過機械的方法打破外圍組織的束縛，增加氧氣及提高透性，以促進發(fā)芽和解除休眠。甘陽英等［9］，以不去種皮為對照，用除去種胚端的種皮（不損傷胚乳）；除去種胚端的種皮和胚乳；剝?nèi)⊥暾叩忍幚?，探究葡萄種皮和胚乳對萌發(fā)的作用發(fā)現(xiàn)，歐美雜種“京亞”除外，去除種胚端的種皮、種皮和胚乳后（胚珠完整），離體種胚的萌發(fā)率顯著增加。這些研究表明機械處理有助于促進葡萄種子萌發(fā)，這為提高葡萄雜交種子萌發(fā)率提供了理論依據(jù)。

3.2 化學(xué)調(diào)控

3.2.1 激素處理 大多研究表明，乙烯、細(xì)胞分裂素（CK）、赤霉素（GA3）、萘乙酸和乙烯利等植物生長調(diào)節(jié)劑能打破某些種子的生理休眠。如卓小能等［21］研究發(fā)現(xiàn)，利等植物生長調(diào)節(jié)劑能打ABA含量較高，用40%石灰氮浸提液浸泡18 h，可打破其休眠；劉會寧等［21］證明了生長調(diào)節(jié)劑在一定程度上能夠促進種子發(fā)芽，但不同藥劑處理對同一品種發(fā)芽效果存在差異，同一藥劑處理對不同品種發(fā)芽效果也存在差異。潘學(xué)軍等［43］在外源激素處理對貴州毛葡萄種子發(fā)芽的影響研究中指出，GA、6-BA對毛葡萄種子活力都有顯著的提高，但 GA處理的發(fā)芽整齊、幼苗質(zhì)量高、整體效果好。而Huseyin等［44］在研究打破葡萄種子休眠過程中發(fā)現(xiàn)，1 500 ppm的GA3處理后，種子萌發(fā)率可達51.72%。而潘學(xué)軍等研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的GA3可顯著提高種子萌發(fā)效率，且不同品種所需濃度不同定濃度。張艷和王慶蓮等［45-46］對GA3打破歐亞種葡萄種子休眠的研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄種子在2 000-2 500 mg/L的GA3溶液中浸泡24 h，萌發(fā)率約60%。因此，盡管激素處理葡萄種子能在一定程度上打破休眠和提高散發(fā)率，但不同激素在不同種群葡萄種子休眠打破方面的作用不盡相同。

3.2.2 無機化學(xué)藥劑處理 研究發(fā)現(xiàn)，濃硫酸、高錳酸鉀、次氯酸鈉和過氧化物等無機化學(xué)藥劑對打破由外圍組織束縛而引起的種子休眠有一定的作用。甘陽英等［9］通過濃硫酸處理葡萄種子休眠發(fā)現(xiàn)：濃硫酸可打破部分種子休眠，且能提高萌發(fā)率，但不同品種所需的濃度及時間不同，濃度和處理時間不當(dāng)會毒害種子，在一定程度上體現(xiàn)出，無機化學(xué)藥劑對打破葡萄種子休眠的具有局限性。

3.3 基因調(diào)控

目前，學(xué)者們已鑒定了大量編碼休眠調(diào)控蛋白的基因［47］（圖3），主要分為調(diào)節(jié)休眠誘導(dǎo)和維持以及與休眠釋放有關(guān)的蛋白，其中DELLA等蛋白與休眠釋放和調(diào)節(jié)GA生物合成有關(guān)，且可以調(diào)控種子萌發(fā)及休眠［29，31］。據(jù)研究報道［48-50］，GA 受體GID1、DELLA蛋白、F-box蛋白和DELLA調(diào)控的靶因子構(gòu)成核心GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，GA與GID1的結(jié)合促進GID1與DELLA抑制因子相互作用，從而通過泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin proteasome pathway）引起DELLA的降解和GA響應(yīng)［51-52］，抑制種子休眠形成；DELLA基因突變（RGA-LIKE2、SPINDLY，即RGL2、SPY），可影響GA生物合成基因，如擬南芥種子的AtSdr4L突變體atsdr4l，引發(fā)GA生物合成降低［53-55］，抑制萌發(fā)；GA處理或加強GA信號，一方面可上調(diào)GA3ox1和GA20ox1的表達及下調(diào)GA2ox1的表達［56-59］，增強GA的合成與信號（ABA的分解代謝），促使種子由休眠狀態(tài)向萌發(fā)轉(zhuǎn)變；反之， 使 GA3ox1、GA20ox1、GA20ox2和 GA20ox3的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；另一方面上調(diào)GA2ox1和GA2ox2（GA分解代謝基因）的轉(zhuǎn)錄水平，一定水平上促ABA信號（ABRES）傳遞，促進種子休眠。

ABI3、ABI4是ABA信號傳導(dǎo)的主要組分［46］，ABI3是下游組分，其表達受DEP（DESPIERTO）調(diào)節(jié)，參與種子發(fā)育調(diào)控，dep種子表現(xiàn)為完全休眠；種子成熟與萌發(fā)過程中，ABI3轉(zhuǎn)錄可被WRKY41直接控制，以此調(diào)節(jié)擬南芥種子的休眠；MYB96通過介導(dǎo)ABI4（種子休眠的正調(diào)節(jié)因子）和ABA 生物合成基因（NCED2 和NCED6）的表達，調(diào)節(jié)種子休眠與萌發(fā)；ABI4 可正調(diào)節(jié)ABA 的分解代謝基因和負(fù)調(diào)節(jié)GA的生物合成基因，促進種子休眠并抑制萌發(fā)；ABI5負(fù)調(diào)節(jié)種子萌發(fā)；CHO1即CHOTTO1（AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子）和SPT是種子休眠中的重要因子，與ABI4關(guān)聯(lián)度大，SPT-ABI4模塊對種子休眠的建立和維持起著關(guān)鍵性作用，AP2 的轉(zhuǎn)錄因子在ABI4的上游起作用，負(fù)向調(diào)節(jié)GA 生物合成，同時正調(diào)節(jié)ABA 生物合成，促使種子休眠。除此之外，ABA可影響組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HvGNAT/MYST、蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因KYP/SUVH4等，參與休眠釋放。雖然進展相對較慢，但激素合成相關(guān)基因的挖掘，一定程度上揭示了激素調(diào)控休眠的機理（圖5），從分子生物學(xué)角度為激素調(diào)控葡萄種子休眠與萌發(fā)提供了理論依據(jù)。

3.4 混合調(diào)控

植物種子的生理休眠基本上都是由胚和種殼雙重原因引起的，往往采用混合手段對其破眠。在葡萄種子的破眠上，Huseyin等［44］利用GA3+層積的組合研究發(fā)現(xiàn)，葡萄種子先用1 500 ppm的GA3處理，再層積35 d，種子萌發(fā)率可達53.21%。Uzun等［60］分別用1 000 ppm的GA3、1 000 ppm的BAP、1 mol/L的H2O2和水浸泡24 h后，5℃層積4個月，結(jié)果表明GA3處理結(jié)合層積處理，葡萄種子萌發(fā)率提高到78.32%。除葡萄種子破眠上應(yīng)用混合手段外，其他種子也有應(yīng)用，如對石刁柏種子萌發(fā)研究中，牛曉雪等［61］采用不同激素和化學(xué)試劑處理混合處理種子，結(jié)果表明10 mg/L IAA＋0.5% FeSO4組合能顯著提高種子萌發(fā)率至95%，提高發(fā)芽高峰至34%，有效縮短發(fā)芽時間，提高成苗效率，一定程度上為混合手段促進葡萄種子高效成苗提供了可行性依據(jù)。

圖5 基因調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Gene-regulated network for seed dormancy and germination

4 總結(jié)與展望

盡管葡萄種子休眠相關(guān)的研究取得了一定進展，但仍存在較多問題，需要結(jié)合現(xiàn)代先進技術(shù)進一步探究其休眠與調(diào)控機制。具體研究方向如下：（1）葡萄種子休眠與萌發(fā)是兩個不同的過程，即獨立又相互聯(lián)系，種子完熟后，只有先打破休眠才能萌發(fā)，但休眠和萌發(fā)又沒有明確的界限及標(biāo)志；（2）與葡萄芽子休眠相比，葡萄種子休眠機制尚未明晰，且鮮有關(guān)于葡萄種子休眠在基因組學(xué)方面的研究，葡萄休眠相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)組急需挖掘；（3）激素調(diào)控方面，雖掌握了ABA與GA和乙烯的關(guān)系（ABA誘導(dǎo)休眠，GA和乙烯釋放休眠并拮抗ABA 的作用），但尚未明確激素調(diào)控技術(shù)的核心；（4）休眠與萌發(fā)調(diào)控方面，目前仍以冷層積、赤霉素等單一技術(shù)為主，綜合技術(shù)研究較少。

上述問題的研究與解決對于打破葡萄種子休眠、促進種子萌發(fā)高效技術(shù)的研究具有重要意義，同時也為解決葡萄雜交種子萌發(fā)率低的問題指明研究方向，一定程度上促進葡萄育種的進程，也為其提供理論依據(jù)與實踐參考。