梁曉玉，崔周磊，王洪成，陳華友

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013)

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidases，LiP)、錳過(guò)氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)、漆酶(Laccase，Lac)等構(gòu)成了白腐菌的主要木質(zhì)素降解酶系，與木質(zhì)素降解輔助酶系協(xié)同降解木質(zhì)素。LiP主要來(lái)源于真菌，是血紅素過(guò)氧化物酶超家族Ⅱ類過(guò)氧化物酶中的一員。在木質(zhì)素降解酶系中，LiP氧化還原電位比MnP、Lac高，除降解木質(zhì)素外，還能降解生態(tài)系統(tǒng)中其他難降解的高分子化合物，這提高了LiP的應(yīng)用價(jià)值。LiP在化學(xué)化工、生態(tài)修復(fù)、生物飼料等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，本文綜述了近年來(lái)LiP的研究進(jìn)展，并對(duì)其研究前景進(jìn)行展望。

1 LiP的催化機(jī)制

LiP有一個(gè)所謂的配體通道，可使小分子底物通過(guò)通道與血紅素直接作用。底物的大小和理化性質(zhì)共同決定其能否通過(guò)配體通道與血紅素反應(yīng)。Ecker等[1]研究發(fā)現(xiàn)，除草劑阿特拉津進(jìn)入配體通道后與通道中某些氨基酸殘基結(jié)合，最終無(wú)法到達(dá)血紅素腔活性位點(diǎn)。這類物質(zhì)與配體通道結(jié)合后能否再被釋放出來(lái)，其與配體通道結(jié)合時(shí)是否會(huì)阻礙其他底物對(duì)血紅素腔的可及性，以及是否會(huì)對(duì)LiP的其他活性位點(diǎn)產(chǎn)生影響，值得深入探究。目前對(duì)配體通道中氨基酸殘基了解有限，明確配體通道中關(guān)鍵氨基酸殘基、分析配體通道的功能是下一步研究的方向，這有利于深入了解LiP作用機(jī)理，并對(duì)LiP改性提供參考。

木質(zhì)素等大分子物質(zhì)無(wú)法通過(guò)通道與血紅素作用，而是通過(guò)酶表面氨基酸殘基經(jīng)長(zhǎng)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制最終與血紅素反應(yīng)。Sandra等[2]提出長(zhǎng)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制兩種可能的電子轉(zhuǎn)移路徑，一種是Phe’s 路徑，按照Trp171-Phe205-Trp251的順序轉(zhuǎn)移自由基，另一種被稱為Phe#2’s 路徑，按照Trp171-Asp264-Phe265-Phe267 的順序轉(zhuǎn)移自由基，這兩種轉(zhuǎn)移路徑與多功能過(guò)氧化物酶中發(fā)現(xiàn)的電子轉(zhuǎn)移路徑類似。雖然對(duì)LiP這兩個(gè)氧化位點(diǎn)有了初步了解，但它們之間的聯(lián)系尚不清楚。

藜蘆醇(Veratryl alcohol，VA)既可作為L(zhǎng)iP催化底物，也可充當(dāng)LiP催化反應(yīng)的介質(zhì)，提升酶促效率。有研究認(rèn)為L(zhǎng)iP氧化VA生成的芳基陽(yáng)離子自由基VA+·可以擴(kuò)散到周圍體系中，拓展LiP作用范圍。這種假說(shuō)被Houtman等[3]否定，他們以黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)LiP(H8)為研究對(duì)象，認(rèn)為真菌LiP不使用VA+·作為擴(kuò)散的木質(zhì)素降解氧化劑，但實(shí)驗(yàn)中并未涉及其他LiP同工酶，對(duì)是否存在LiP以VA+·為擴(kuò)散氧化劑還需進(jìn)一步研究。

2 LiP酶活測(cè)定

基于毛細(xì)管電泳的膠束電動(dòng)色譜法可應(yīng)用于未純化、未濃縮的微量LiP酶活測(cè)定。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法是色譜和電泳分離原理相結(jié)合的一種復(fù)合方法，首先通過(guò)電泳分離目標(biāo)產(chǎn)物，然后通過(guò)色譜進(jìn)行定量分析[4]。Airi等[5]已成功應(yīng)用該方法測(cè)定LiP活性。研究發(fā)現(xiàn)，某些底物如VA和Mn2+，LiP和MnP均具有氧化能力，但它們對(duì)同種底物氧化的能力不同，Sumire等[6]基于此，應(yīng)用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法成功測(cè)定了LiP和MnP混合體系中LiP和MnP活性。這種基于酶活差異同時(shí)測(cè)定混合體系中不同酶酶活的方法理論上適用于兩種或兩種以上酶的混合體系，但使用時(shí)體系中酶的種類要與底物種類一致，否則難以計(jì)算。

膠束電動(dòng)色譜法靈敏、準(zhǔn)確，且樣品無(wú)需濃縮，可直接用于酶活測(cè)定，但其對(duì)設(shè)備要求較高，實(shí)驗(yàn)條件限制了膠束電動(dòng)色譜法的廣泛推廣。目前LiP酶活測(cè)定主要還是通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行，VA、天青B等物質(zhì)均可作為分光光度法測(cè)LiP酶活的底物。藜蘆醇氧化法測(cè)LiP酶活的原理是LiP在H2O2存在時(shí)催化VA轉(zhuǎn)化為藜蘆醛，根據(jù)310 nm處吸光度變化值計(jì)量LiP酶活[7]。天青B法通過(guò)監(jiān)測(cè)OD651處吸光度變化計(jì)量LiP酶活。酶活測(cè)定時(shí)，310 nm處吸光度易受粗酶液中芳香化合物及其他過(guò)氧化物酶干擾，651 nm處吸光度受此影響較小，但天青B法測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，因此，當(dāng)測(cè)量體系中干擾較多且時(shí)間允許時(shí)，可選擇天青B法；當(dāng)測(cè)量體系干擾較少時(shí)，藜蘆醇氧化法更加便捷。

對(duì)比不同研究發(fā)現(xiàn)，即使選擇同種底物，LiP酶活測(cè)定體系中緩沖液、pH值、反應(yīng)體系也存在差異[8-10]，這使得不同研究中的LiP酶活不具有對(duì)比性，因此，亟須制定LiP酶活測(cè)定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

3 LiP克隆表達(dá)

天然產(chǎn)LiP菌株產(chǎn)酶不穩(wěn)定，表達(dá)量低，所產(chǎn)LiP其性質(zhì)多不適用于工業(yè)生產(chǎn)，因此，人們將LiP異源表達(dá)以提高LiP的表達(dá)量、改善LiP的理化性質(zhì)，使其更滿足人們的應(yīng)用需求。LiP主要在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)，獲得純品蛋白后進(jìn)行酶學(xué)鑒定。值得注意的是，木質(zhì)素降解酶類其酶學(xué)性質(zhì)鑒定多以木質(zhì)素結(jié)構(gòu)類似物為底物，缺乏真正意義上以秸稈中木質(zhì)素為底物的性能評(píng)估。崔周磊等[11]將來(lái)源于白囊耙齒菌(Irpexlacteus)的MnP在大腸桿菌中異源表達(dá)，以木質(zhì)素為底物評(píng)估所得MnP效能，所得MnP可使玉米秸稈、麩皮中木質(zhì)素降解率分別可達(dá)35.8%和27.3%，這種酶活鑒定方法使得酶的應(yīng)用潛力更加直觀。

雖然已有數(shù)個(gè)LiP在大腸桿菌中成功過(guò)表達(dá)，但目的蛋白多以包涵體形式產(chǎn)生，分離純化復(fù)性不便，且其生物安全性存在疑問(wèn)，工業(yè)化尤其是食品工業(yè)級(jí)應(yīng)用困難。出于工業(yè)化應(yīng)用的目的，LiP克隆表達(dá)需要選擇合適的受體菌。LiP在其他表達(dá)系統(tǒng)如黑曲霉、桿狀病毒等克隆表達(dá)的研究也有報(bào)道，但應(yīng)用價(jià)值較低[12-13]；肖建龍等[14]在食品微生物釀酒酵母中成功表達(dá)有活性LiP，但實(shí)用性未知?？莶菅挎邨U菌作為飼用菌種，一般具有生物安全性，且生長(zhǎng)速度快，能夠產(chǎn)生大量胞外蛋白，因此有望作為L(zhǎng)iP胞外表達(dá)的工業(yè)級(jí)宿主。目前已篩選得到可以胞外分泌LiP的枯草芽孢桿菌[8]，為提升LiP胞外表達(dá)量，需要進(jìn)一步優(yōu)化啟動(dòng)子和信號(hào)肽。由于釀酒酵母的ADH7啟動(dòng)子可以在木質(zhì)素衍生物香蘭素濃度達(dá)到一定限度時(shí)啟動(dòng)目的基因表達(dá)降解香蘭素[15]，香蘭素既是誘導(dǎo)物又是底物，這類高效低成本產(chǎn)LiP的啟動(dòng)子有望應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)LiP。

工業(yè)化應(yīng)用時(shí)，LiP需要耐受環(huán)境因素的影響，天然LiP穩(wěn)定性不高，耐受能力不強(qiáng)，因此，除通過(guò)基因工程提升酶的產(chǎn)量外，還應(yīng)提升酶的穩(wěn)定性，使其更能耐受環(huán)境影響。Semba 等[16]構(gòu)建真菌過(guò)氧化物酶系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，推斷真菌LiP祖先氨基酸序列，并設(shè)計(jì)多個(gè)含有祖先氨基酸殘基的突變酶，所得突變酶熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型；Karla等[9]構(gòu)建LiP基因的隨機(jī)誘變文庫(kù)，所得突變LiP能耐受更高濃度的H2O2；Le等[17]在黃孢原毛平革菌LiP(H8)中引入鹽橋，提高了LiP的耐酸性，工程酶在極端酸性條件下的半衰期提高了12.5倍。耐受極端環(huán)境的酶可以拓寬酶的工作范圍，其合成對(duì)LiP工業(yè)化應(yīng)用具有重大意義。

4 LiP與木質(zhì)素降解

木質(zhì)素是由松柏醇、芥子醇和對(duì)香豆醇3種醇單體聚合而成的高分子化合物，這些醇單體通過(guò)碳碳鍵、醚鍵互相偶聯(lián)，然后通過(guò)自由基機(jī)制聚集形成木質(zhì)素聚合物[18]，這種聚合物包被著纖維素和半纖維素，且本身結(jié)構(gòu)緊密，限制木質(zhì)纖維素的利用。

LiP在H2O2存在時(shí)可以氧化各種酚類芳香底物、非酚類木質(zhì)素以及一系列氧化還原電位高于1.4 V的化合物，被認(rèn)為是木質(zhì)素降解最高效的酶[19]。LiP催化非酚類木質(zhì)素降解時(shí)，從酚或苯環(huán)上提取一個(gè)電子生成自由基，然后通過(guò)后續(xù)的非酶反應(yīng)經(jīng)側(cè)鏈裂解、去甲基化、分子內(nèi)加成和重排等方式破壞木質(zhì)素分子的主要化學(xué)鍵，導(dǎo)致木質(zhì)素降解[20]。LiP催化木質(zhì)素中的芳香環(huán)發(fā)生裂解，裂解生成的酚衍生物轉(zhuǎn)化為醌類化合物后，經(jīng)一系列酶的協(xié)同作用，以纖維二糖酸內(nèi)酯的形式進(jìn)入三羧酸循環(huán)或戊糖磷酸途徑，終產(chǎn)物為CO2[21]。LiP降解木質(zhì)纖維素的效果多用木質(zhì)纖維素降解率衡量，此外，LiP降解木質(zhì)纖維素后還原糖、總酚量、酚羥基含量等指標(biāo)也被用于描述木質(zhì)素降解程度[22-23]，因木質(zhì)素降解產(chǎn)物多樣[24]，多指標(biāo)相互驗(yàn)證才能更準(zhǔn)確地評(píng)估LiP降解木質(zhì)素的效果。

5 LiP的協(xié)同作用與應(yīng)用前景

5.1 LiP用于化工行業(yè)

LiP可降解黑色素，可替代美白產(chǎn)品中常用的苯二酚[7]。LiP的催化活性依賴于H2O2，但高濃度的H2O2會(huì)導(dǎo)致LiP失活，因此，美白產(chǎn)品中需要持續(xù)存在低濃度的H2O2。HO等[25]在美白產(chǎn)品中協(xié)同LiP與葡萄糖氧化酶，利用葡萄糖氧化酶生成的H2O2催化LiP對(duì)黑色素脫色，避免了高濃度H2O2使LiP失活，提高了黑色素的脫色效率。此外，LiP降解木質(zhì)素產(chǎn)生的二元羧酸、小分子酚類物質(zhì)等是重要化工原料，如：LiP降解木質(zhì)素產(chǎn)生的香蘭素可代替天然香蘭素用于食品、化妝品行業(yè)；LiP作用于木質(zhì)纖維素，脫木質(zhì)素后作為原料生產(chǎn)乙醇等。LiP在化學(xué)化工行業(yè)的更多應(yīng)用潛力尚待挖掘。

5.2 LiP用于生態(tài)修復(fù)

生態(tài)系統(tǒng)中的紡織廢水、農(nóng)藥、抗生素等有機(jī)化合物嚴(yán)重威脅著人類健康，但環(huán)境中這些污染物濃度較低，且種類多樣，LiP雖然具有很強(qiáng)的降解這些污染物的能力，但其產(chǎn)量少，難以大規(guī)模投放；底物譜有限，單獨(dú)作用效果不佳[26]。Pylypchuk等[27]將辣根過(guò)氧化物酶與LiP固定到納米粒子上，多酶協(xié)同固定化不僅使酶作為催化劑可以重復(fù)使用，還提高了污染物的降解效率。pail等[28]將產(chǎn)LiP的細(xì)菌和其他細(xì)菌同時(shí)投放到紡織廢水污染的土地上，發(fā)現(xiàn)混合微生物的染料脫色和解毒作用比單菌株更明顯。多酶或菌酶協(xié)同一定程度上提升了酶的利用效率，然而，這種投放方式針對(duì)性不強(qiáng)。根據(jù)底物特征，有規(guī)劃地投放合理的復(fù)合酶系能更有效地提升利用率，這需要我們?cè)谕斗胖澳軌蛎鞔_體系中底物種類及其與酶的作用潛力。Berbar等[29]首次嘗試并建立了一套評(píng)估底物對(duì)酶敏感性的理化指標(biāo)，評(píng)估了25種有機(jī)污染物的氧化還原酶敏感性，敏感性評(píng)分與降解率基本一致。類此，建立LiP對(duì)底物敏感性的理化指標(biāo)，評(píng)估底物敏感性后，針對(duì)性投放合理的酶處理體系可以避免酶無(wú)效投放。

5.3 LiP與生物飼料

中國(guó)秸稈資源豐富，但沒(méi)能得到充分利用，木質(zhì)素降解菌或者酶處理秸稈后轉(zhuǎn)化為生物飼料，既能提高秸稈利用率，又解決了牧區(qū)牛羊粗飼料短缺、人畜爭(zhēng)糧爭(zhēng)地的問(wèn)題。

秸稈中高含量的木質(zhì)纖維素成分難以被動(dòng)物消化，且影響飼料適口性。微生物發(fā)酵后的秸稈中木質(zhì)纖維素被降解成易于吸收的含糖物質(zhì)，既提高了適口性，又提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。實(shí)際應(yīng)用中，單一菌種底物譜有限，酶活普遍較低，不能滿足降解需求，而多菌種混合發(fā)酵可以提供較為完整的木質(zhì)纖維素酶體系，提高降解效率，降低時(shí)間成本，提高微生物對(duì)大規(guī)模應(yīng)用的適用性[30]。粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)含有豐富的纖維素降解基因，表達(dá)數(shù)種纖維素降解酶，能夠有效降解纖維素[31]。崔周磊[32]將MnP基因克隆于食品安全級(jí)粟酒裂殖酵母中，工程菌協(xié)同粗糙脈孢菌等發(fā)酵菌種制備秸稈生物飼料，與單菌種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵過(guò)程中菌酶協(xié)同作用轉(zhuǎn)化了菌種之間對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)，提高了發(fā)酵的效率和品質(zhì)。除食品級(jí)粟酒裂殖酵母外，木質(zhì)素降解酶在飼用菌種如枯草芽孢桿菌中克隆表達(dá)有助于推進(jìn)秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物飼料化。

6 總結(jié)與展望

LiP具有強(qiáng)大應(yīng)用潛力，但無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用，根本原因是產(chǎn)酶菌生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)酶量低，以及酶本身性質(zhì)限制，因此，LiP的克隆表達(dá)應(yīng)圍繞受體菌、表達(dá)量、酶學(xué)性質(zhì)3個(gè)方面。對(duì)工程菌質(zhì)量的綜合評(píng)估，應(yīng)以應(yīng)用目的為基準(zhǔn)，如在生物飼料行業(yè)中，LiP的安全性至關(guān)重要，LiP的克隆宿主應(yīng)選擇無(wú)抗，生物安全且可用于飼料的菌種，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酶量及酶學(xué)性質(zhì)；在環(huán)境治理中，普遍認(rèn)為真菌抗逆性優(yōu)于細(xì)菌，因此，受體菌應(yīng)優(yōu)先選擇真菌，受體菌中酶活力也不是評(píng)估工程菌質(zhì)量的唯一標(biāo)準(zhǔn)，酶的適用性和酶活力共同決定酶的應(yīng)用價(jià)值。此外，如何使LiP高效應(yīng)用是研究的另一個(gè)重點(diǎn)。小分子介質(zhì)被認(rèn)為能夠拓寬酶底物范圍，提升酶活力，目前對(duì)LiP-介質(zhì)系統(tǒng)的研究落后于MnP和Lac，且相關(guān)研究多為ABTS、HBT、HAA等介質(zhì)，這類介質(zhì)價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用，理想介質(zhì)應(yīng)該高效提升酶活，且不會(huì)給環(huán)境帶來(lái)污染，同時(shí)廉價(jià)、易于獲取且高效，因此，還需進(jìn)一步篩選優(yōu)質(zhì)LiP介質(zhì)。酶與酶之間協(xié)同作用已經(jīng)被證實(shí)[24]，除木質(zhì)素降解酶之間的協(xié)同外，構(gòu)建作用范圍廣且高效的完整酶系可大大提升LiP的應(yīng)用價(jià)值。