魏博帆，王 露，李曉哲，李小輝，李苗苗，喬惠麗

(南陽師范學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽 473061)

微生物在自然界中廣泛存在，發(fā)揮著不可或缺的重要作用，大量微生物長期生存在動物體表或體內(nèi)與宿主形成共生關(guān)系，并影響宿主的生長代謝和行為，尤其是腸道微生物與宿主之間的相互作用是最近國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在昆蟲中，腸道菌群的變化可直接影響宿主的取食[1-3]、發(fā)育[3-6]、產(chǎn)卵[2-3,7]和營養(yǎng)代謝[8-9]，在哺乳動物中，腸道微生物的變化甚至可導(dǎo)致疾病和癌癥的發(fā)生[10]。

果蠅作為重要的模式生物之一，其腸道微生物種類相對簡單，且腸道微生物可通過垂直轉(zhuǎn)移從親代果蠅轉(zhuǎn)移到子代體內(nèi)，因此果蠅是研究腸道微生物與宿主互作關(guān)系的理想材料。研究表明，作為果蠅腸道中的主要微生物之一，植物乳桿菌可通過調(diào)控TOR和生長激素信號通路促進(jìn)果蠅的生長發(fā)育[11-13]。Becher等[14]發(fā)現(xiàn)酵母菌的代謝產(chǎn)物是吸引果蠅在成熟水果表面產(chǎn)卵的主要因素。Keesey等[15]發(fā)現(xiàn)在果蠅糞便中存在果蠅性信息素成分，而果蠅在水果表面留下的糞便可吸引其他果蠅的覓食和聚集。Sharon等[16]發(fā)現(xiàn)果蠅腸道共生菌植物乳桿菌在其交配偏好中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可誘導(dǎo)果蠅更偏好選擇與其腸道微生物組成相似的同伴進(jìn)行交配。Morimoto等[17]研究表明，腸道微生物對果蠅的交配和繁殖不僅具有直接影響，同時還有一定的跨代影響。但關(guān)于腸道微生物對果蠅交配行為的影響和調(diào)控機(jī)制的研究還很有限。

由于果蠅腸道微生物菌群易受外界寄生環(huán)境中微生物的不同而改變，不同種類果蠅的地域分布不同，其腸道微生物的優(yōu)勢菌群也有所不同，可能在果蠅種間的生殖隔離中發(fā)揮作用[18-19]。目前發(fā)現(xiàn)野生果蠅的腸道微生物約有50種，而實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)果蠅的腸道微生物僅十幾種，主要為乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬微生物，這些腸道共生菌可在宿主外進(jìn)行培養(yǎng)[19-22]。研究首先通過建立無菌果蠅體系，選取具有代表性的黑腹果蠅腸道微生物植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和醋酸桿菌(Acetobacteriummalorum)及果蠅培養(yǎng)基中添加的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別對無菌果蠅和正常果蠅接種特定微生物，利用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測接種后對應(yīng)微生物在無菌果蠅和正常果蠅體內(nèi)的富集情況，并檢測不同腸道微生物對無菌果蠅和正常果蠅交配行為的影響，從而為腸道微生物與果蠅的互作研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和昆蟲

實(shí)驗(yàn)所用微生物菌株植物乳桿菌(L.plantarum，20174)、醋酸桿菌(A.malorum，14337)和釀酒酵母(S.cerevisiae，1333)購自DSMZ德國微生物菌種保藏中心。L.plantarum和A.malorum用MRS肉湯培養(yǎng)基，S.cerevisiae用YPD培養(yǎng)基于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

實(shí)驗(yàn)所用的果蠅品系為野生型黑腹果蠅，培養(yǎng)條件為25 ℃，相對濕度為70%，光周期為12L∶ 12D。果蠅培養(yǎng)基的成分為(1 L)：紅糖118 g，啤酒酵母粉22 g，玉米粉95 g，瓊脂4.2 g，丙酸2.4 mL，30%對羥基甲酸甲酯3.3 mL。無菌果蠅培養(yǎng)基需將配好的正常培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理后，再加入丙酸和30%對羥基甲酸甲酯。用于果蠅卵收集的葡萄汁固體培養(yǎng)基的成分為(100 mL)：葡萄汁100 mL，乙酸1 mL，乙醇1 mL，瓊脂糖1 g。收集果蠅卵時需在平板上涂抹適量的酵母膏。

1.2 試劑和儀器

MRS、YPD和LB培養(yǎng)基購自Solarbio公司，對羥基甲酸甲酯、次氯酸鈉和丙酸購自天津化學(xué)試劑廠，RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermofisher公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑購自Roche。紫外分光光度計(jì)為德國Eppendorf，恒溫培養(yǎng)箱和恒溫?fù)u床為上海智誠，超微量核酸蛋白濃度測定儀為Nanodrop2000。

1.3 無菌果蠅體系的建立

1.3.1 無菌果蠅體系

收集新羽化的果蠅，將其轉(zhuǎn)移至用于收集果蠅卵的產(chǎn)卵裝置中，該裝置為100 mL的塑料燒杯，底部挖洞并用尼龍網(wǎng)密封以保證透氣性，用涂有酵母膏的葡萄汁固體培養(yǎng)基平板蓋住杯口，倒置于果蠅培養(yǎng)箱中，2 d后更換新的帶有酵母膏的葡萄汁平板，收集產(chǎn)下后6 h以內(nèi)的果蠅卵。將收集的果蠅卵于超凈工作臺中進(jìn)行表面消毒處理，步驟依次：無菌水清洗卵表面3次，每次1 min；4%的次氯酸鈉溶液消毒處理5 min，75%的乙醇清洗2次，每次2 min；無菌水清洗3次，每次2 min，處理好的卵用無菌濾紙吸去多余水分后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)[23-24]。

1.3.2 無菌果蠅體系的驗(yàn)證

無菌培養(yǎng)果蠅羽化后，取10只果蠅解剖腸道，加適量無菌水充分研磨，將研磨液分別涂于YPD、MRS和LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后觀察培養(yǎng)基上的菌落生長情況，若無菌落生長則成功獲得無菌果蠅，如有菌落則說明消毒不徹底，丟棄并重新收集和處理新的果蠅卵。

1.4 正常及無菌果蠅的微生物接種及鑒定

1.4.1 果蠅腸道微生物的培養(yǎng)和接種

S.cerevisiae接種于YPD液體培養(yǎng)基，L.plantarum和A.malorum接種于MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)24 h，按照1 mL OD600=1新鮮菌液(L.plantarum和A.malorum約108個細(xì)胞，S.cerevisiae約106個細(xì)胞)離心洗滌后，重懸于100 μL PBS的制備菌液樣品，然后中號培養(yǎng)瓶每瓶100 μL菌液，小號培養(yǎng)瓶每瓶50 μL菌液，加入到果蠅培養(yǎng)瓶中，并使菌液均勻鋪滿培養(yǎng)基表面。取新羽化的無菌果蠅或正常果蠅成蟲各30頭，分別置于接種有微生物的果蠅培養(yǎng)瓶中，每12 h更換1次接菌培養(yǎng)基，2 d后收集果蠅檢測[3]。

1.4.2 接種果蠅的鑒定

為了進(jìn)一步檢測不同果蠅腸道中活體微生物的豐度變化，不同于傳統(tǒng)提取DNA做模板擴(kuò)增微生物的rRNA，我們解剖果蠅腸道，液氮研磨，Trizol試劑提取果蠅腸道總RNA，RevertAid反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA作為模板，以宿主果蠅rp49為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測3種微生物在不同果蠅腸道中豐度，并比較不同方法對果蠅接種微生物后腸道中相應(yīng)微生物的豐度變化[12,25]。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板1 μL，正向引物/反向引物(10 μmol/L)各0.3 μL，PCR通用型預(yù)混液3.4 μL，加ddH2O至10 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品3個重復(fù)。L.plantarum和A.malorum的16S rRNA，S.cerevisiae的18S rRNA及果蠅rp49的特異引物見表1。

1.5 果蠅的交配實(shí)驗(yàn)

選取新羽化的未交配的雌雄果蠅，未交配雄蠅每只單獨(dú)于正?；蚪臃N特定微生物的小號培養(yǎng)瓶中飼養(yǎng)，未交配雌蠅30只于正?；蚪臃N特定微生物的中號培養(yǎng)瓶中飼養(yǎng)，每12 h更換1次培養(yǎng)基，4～5日齡的果蠅用于單對交配實(shí)驗(yàn)。果蠅單對交配實(shí)驗(yàn)在一個高0.5 cm，半徑為1 cm，帶透明蓋的圓形交配裝置中進(jìn)行。觀察果蠅的交配行為，記錄雌雄果蠅成功交配所需的時間(交配潛伏期)及30 min內(nèi)果蠅的交配成功率，每組10個重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Prism5.0軟件用于繪圖和數(shù)據(jù)分析。qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算方法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析(ΔCt=Ct樣品-Ct內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌果蠅體系的建立

將新羽化的無菌果蠅和正常果蠅解剖腸道，研磨后平板培養(yǎng)，比較無菌果蠅與正常果蠅的腸道勻漿后在相應(yīng)培養(yǎng)基上的生長情況。結(jié)果(圖1)顯示，平板培養(yǎng)48 h后，正常果蠅的腸道勻漿物在3種不同培養(yǎng)基上都長出大量菌落，而無菌果蠅的腸道勻漿物，在3種不同培養(yǎng)基上都未長出任何菌落，由此表明，無菌果蠅體系構(gòu)建成功。

(a)YPD平板；(b)MRS平板；(c)LB平板

2.2 果蠅腸道中特定微生物的分子檢測

將正常果蠅和無菌果蠅分別在接種有S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過qRT-PCR分別檢測3種微生物在接種前后正常果蠅和無菌果蠅腸道中的豐度變化。無菌果蠅接種前后的檢測結(jié)果(圖2)顯示，S.cerevisiae只在接種了該微生物的果蠅中大量存在，而在對照果蠅、接種L.plantarum和A.malorum的果蠅中幾乎不存在[圖3(a)]，L.plantarum和A.malorum也僅在接種了該微生物的果蠅中檢測到大量存在，而在對照果蠅及接種其他2種微生物的果蠅腸道中幾乎不存在[圖 3(b)和(c)]。由此表明，通過在無菌果蠅培養(yǎng)基中添加特定微生物并對無菌果蠅進(jìn)行培養(yǎng)可以成功獲得該微生物的悉生果蠅。

1：無菌果蠅；2：接種S. cerevisiae的果蠅；3：接種L. plantarum的果蠅；4：接種A. malorum的果蠅

正常果蠅接種前后的檢測結(jié)果如圖3所示。S.cerevisiae、L.plantarum和A.malorum在正常果蠅腸道以較低水平存在，接種后的結(jié)果與無菌果蠅的結(jié)果類似，3種微生物都在接種了特定微生物的正常果蠅中大量存在，而接種其他兩種微生物的正常果蠅腸道中不表達(dá)或極少量表達(dá)。由此表明，通過相同的方法對正常果蠅進(jìn)行培養(yǎng)，同樣可以達(dá)到特定微生物在果蠅腸道中大量富集的效果。

1：正常果蠅；2：接種S. cerevisiae的果蠅；3：接種L. plantarum的果蠅；4：接種A. malorum的果蠅

2.3 腸道微生物對無菌果蠅和正常果蠅交配行為的影響

將無菌未交配的雌雄果蠅、接種S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的未交配的雌雄果蠅分別進(jìn)行單對交配實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：4組果蠅在30 min內(nèi)的交配成功率均為100%，但是接種了L.plantarum的雌雄果蠅的交配潛伏期顯著高于其他3組果蠅，而其他3組果蠅的交配潛伏期無差異[圖4(a)]。同時，正常果蠅及接種了S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的正常果蠅的交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果與無菌果蠅的結(jié)果一致，4組果蠅在30 min內(nèi)的交配成功率均為100%，而接種L.plantarum的雌雄果蠅交配潛伏期顯著高于其他3組果蠅[圖4(b)]。由此表明，果蠅腸道微生物L(fēng).plantarum可以通過延長交配潛伏期影響果蠅成功交配前的相互識別，且在無菌果蠅和正常果蠅中的結(jié)果一致。

1：對照果蠅；2：接種S. cerevisiae 的果蠅；3：接種L. plantarum的果蠅；4：接種A. malorum的果蠅

3 討論與結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)方法成功建立了無菌果蠅模型，并通過接種植物乳桿菌L.plantarum、醋酸桿菌A.malorum或釀酒酵母S.cerevisiae獲得特定微生物的悉生果蠅。同時為了模擬自然界中黑腹果蠅取食過程中攝入的微生物對其腸道微生物菌群及行為的影響，采用相同的方法對正常果蠅進(jìn)行特定微生物的接種，從而使L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae在正常果蠅腸道中大量富集，進(jìn)而改變正常果蠅腸道微生物的菌群比例。已有研究表明，利用qRT-PCR以宿主管家基因作為內(nèi)參比較分析腸道微生物16S rRNA的表達(dá)量，其結(jié)果與16S rRNA的測序結(jié)果一致[25]。同時提取細(xì)菌的RNA，反轉(zhuǎn)錄后對其16S rRNA進(jìn)行檢測，其結(jié)果不僅與活菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果一致，還可避免樣品中死亡細(xì)菌的干擾[26-27]。本研究的qRT-PCR結(jié)果表明，接種L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae后正常果蠅腸道內(nèi)該活體微生物的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他微生物，從而達(dá)到了改變正常果蠅腸道內(nèi)微生物菌群比例的效果。進(jìn)一步通過觀察接種L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae前后無菌果蠅和正常果蠅的單對交配情況，發(fā)現(xiàn)無論是正常果蠅還是無菌果蠅，與對照及接種A.malorum或S.cerevisiae的果蠅相比，在接種L.plantarum后果蠅的交配潛伏期顯著升高，但對果蠅的交配成功率沒有顯著影響，由此表明單一植物乳桿菌L.plantarum可影響黑腹果蠅的交配前的相互識別。已知在動物中，腸道微生物可影響或改變宿主體表揮發(fā)性化合物的分泌[28-29]。在果蠅中，Keesey等[30]發(fā)現(xiàn)病原菌感染果蠅后可改變果蠅體表聚集信息素的分泌，感染病原菌的果蠅釋放的信息素化合物急劇增加，從而吸引果蠅交配，同時感染更多果蠅以利于病菌的擴(kuò)散。研究發(fā)現(xiàn)接種L.plantarum后果蠅的交配潛伏期延長，初步推測L.plantarum可能影響果蠅體表性信息素化合物的分泌，從而影響果蠅交配前期的相互識別。此外，研究發(fā)現(xiàn)，果蠅的行為不僅是受單一微生物的直接影響，腸道微生物與微生物之間還可通過相互作用，進(jìn)而產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物來影響果蠅的行為[31]。由此可見，腸道微生物對果蠅行為的調(diào)控方式復(fù)雜多樣，在自然界中，果蠅在環(huán)境取食中攝入的微生物可改變其腸道微生物的菌群，進(jìn)而影響其交配行為，從而在不同果蠅的種間生殖隔離或物種進(jìn)化中發(fā)揮作用。然而，腸道微生物影響果蠅交配行為的機(jī)制目前還不清楚，腸道微生物通過改變果蠅的哪種性信息素成分進(jìn)而延長果蠅的交配潛伏期，還有待進(jìn)一步深入研究。

研究成功構(gòu)建了無菌果蠅體系，并獲得了L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae的悉生果蠅；同時對正常果蠅接種3種微生物，也使特定微生物在正常果蠅腸道中成功富集；而且植物乳桿菌L.plantarum作為果蠅重要的腸道細(xì)菌，不僅可影響果蠅的交配偏好，還可通過延長交配潛伏期影響果蠅交配前的相互識別。該研究結(jié)果為后續(xù)果蠅腸道微生物與宿主之間的研究提供了新的思路；同時腸道微生物可以影響宿主的交配行為也為利用昆蟲共生菌進(jìn)行病蟲害防控提供了依據(jù)。