田連華，張 童，蔡海波，譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

ESCs動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞堆積生長(zhǎng)形成的聚集體過(guò)大，往往會(huì)因物質(zhì)傳遞阻力，造成其內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭和代謝廢物積累，導(dǎo)致聚集體內(nèi)部細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象[1-3]；此外，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí)，攪拌所產(chǎn)生的剪切力也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞老化[4]。細(xì)胞老化是限制ESCs擴(kuò)增的主要因素之一。細(xì)胞老化有99%是由自由基損傷所致[5-6]。眾多自由基中超氧陰離子和羥自由基等活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)對(duì)細(xì)胞毒作用最為突出[7-8]?？箟难嶙鳛閺V泛應(yīng)用的天然抗氧化物之一，可以有效調(diào)節(jié)ROS水平[9-10]。然而，抗壞血酸是否能夠調(diào)節(jié)ESCs的ROS水平，延緩細(xì)胞老化進(jìn)程，促進(jìn)ESCs的擴(kuò)增和干性維持，目前尚不明確。因此，以解決細(xì)胞老化問(wèn)題作為切入點(diǎn)，選取mESCs作為研究對(duì)象，研究微載體動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞老化的解決策略。

1 材料與方法

1.1 材料

mESCs由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司干細(xì)胞資源庫(kù)與干細(xì)胞研究關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)提供。細(xì)胞培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(Knockout DMEM，Gibco)，使用時(shí)添加15%胎牛血清(Hyclone)、10 ng/mL白血病抑制因子(Perprotech)、1%青霉素-鏈霉素(Beyotime)、1%非必須氨基酸(Sigma)、1%谷氨酰胺(Sigma)以及0.1 mmol/L β-巰基乙醇(Sigma)。實(shí)驗(yàn)組添加抗壞血酸(Sigma)。微載體Cytodex3(GE Healthcare Biosciences AB)，轉(zhuǎn)瓶(Corning)。

1.2 方法

1.2.1 mESCs的動(dòng)態(tài)擴(kuò)增培養(yǎng)

稱取0.08 g/瓶(1 mg/mL，80 mL培養(yǎng)體系)的Cytodex3加PBS室溫水合過(guò)夜。次日用PBS清洗2次，120 ℃高壓蒸汽滅菌50 min，冷卻后加至40 mL培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。將mESCs以1×105mL-1的密度接至轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為30 r/min，每隔27 min攪拌3 min，持續(xù)8 h以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。接種24 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液至培養(yǎng)體積為80 mL。研究設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組從第2天起每天向培養(yǎng)體系中添加50 μg/mL抗壞血酸，而對(duì)照組不添加。從第3天開(kāi)始兩組均每天半量換液。培養(yǎng)過(guò)程中每2天均勻吸取1 mL聚集體懸液，用0.25%胰酶溶液消化成單細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，換算得出1 mL聚集體懸液中的細(xì)胞密度，總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)計(jì)算公式：

總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)=

[1 mL聚集體懸液細(xì)胞密度(mL-1)×80 mL]/

[1×105mL-1×80 mL]。

1.2.2 SSEA-1+細(xì)胞比例測(cè)定

SSEA-1作為mESCs表面特異性抗原，SSEA-1+細(xì)胞的比例可反映培養(yǎng)物中mESCs的數(shù)量多少。將取得的細(xì)胞樣品一分為二，抗體稀釋液洗2次，一份樣品加入10 μL抗鼠PE-SSEA-1抗體(BD)后混勻，另一份不加抗體作為空白對(duì)照。置于4 ℃避光孵育30 min后再用抗體稀釋液洗2次，離心后加入500 μL抗體保存液保存。標(biāo)記好的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria I)檢測(cè)，用FlowJo軟件分析結(jié)果。SSEA-1+細(xì)胞比例和SSEA-1+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)計(jì)算公式：

SSEA-1+細(xì)胞比例=

[樣本(Q2+Q3)數(shù)值-空白對(duì)照(Q2+Q3)數(shù)值]×100%

SSEA-1+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)=

[SSEA-1+細(xì)胞比例(%)×總細(xì)胞量]/

[接種時(shí)SSEA-1+細(xì)胞比例(%)×接種時(shí)總細(xì)胞量]。

1.2.3 堿性磷酸酶染色

細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)的活性越高，AKP染色的著色越深，說(shuō)明細(xì)胞干性維持越強(qiáng)。因此，根據(jù)AKP染色結(jié)果評(píng)判mESCs的細(xì)胞質(zhì)量。將細(xì)胞樣品用4%多聚甲醛室溫固定15 min，按照堿性磷酸酶染色試劑盒(Beyotime)要求染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 OCT-4蛋白免疫熒光染色

OCT-4蛋白是評(píng)價(jià)細(xì)胞是否為ESCs的指標(biāo)之一。將細(xì)胞樣品在4%多聚甲醛溶液中固定15 min，0.1% TritonX-100溶液處理10 min。重組人抗OCT-4單克隆抗體(Millipore，1∶ 200)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(Millipore)室溫孵育2 h，PBS洗滌3次。DAPI染色液(1∶ 1 000)室溫復(fù)染10 min，PBS洗滌3次。處理好的細(xì)胞用熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti-S)觀察并拍照。

1.2.5 RT-PCR

采用RT-PCR進(jìn)行全能性基因Sox2的mRNA表達(dá)水平測(cè)定。細(xì)胞用Trizol裂解液裂解，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR擴(kuò)增儀(博華生物科技)擴(kuò)增cDNA溶液：Ⅰ階段 94 ℃預(yù)變性5 min。Ⅱ階段94 ℃預(yù)變性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。Ⅲ階段72 ℃延伸7 min。Ⅳ階段4 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳儀在120 V恒壓條件下進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。RT-PCR過(guò)程中所用的引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6 SA-β-Gal活性染色(定性檢測(cè))

細(xì)胞內(nèi)老化相關(guān)的β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase, SA-β-gal)的活性是反映細(xì)胞老化的一個(gè)指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生老化，其胞內(nèi)SA-β-gal的活性上調(diào)，可催化β-半乳糖底物生成藍(lán)色的沉積產(chǎn)物。將細(xì)胞樣品用4%多聚甲醛室溫固定15 min，按照SA-β-Gal活性染色試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC.)使用說(shuō)明書染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 SA-β-Gal酶活力測(cè)定(定量檢測(cè))

采用比色法定量測(cè)定細(xì)胞裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老狀況。按照SA-β-Gal定量檢測(cè)試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC.)使用說(shuō)明書進(jìn)行活性測(cè)定，計(jì)算公式：SA-β-Gal酶活力(IU/cells)=(OD×0.072×V×ρ)/(6×5.5×0.6×t×n)，其中，OD為使用分光光度計(jì)(Beckman)在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的樣品吸光度值，0.072為反應(yīng)體系總體積0.072 mL，V為5×105cells細(xì)胞裂解的懸液體積0.05 mL，ρ為使用BCA試劑盒(Beyotime)測(cè)定的細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度μg/mL，6為測(cè)定酶活時(shí)取等量蛋白量6 μg，5.5為mmol吸光系數(shù)，0.6為所用分光光度計(jì)的光徑距離，t為反應(yīng)時(shí)間min，n為取樣細(xì)胞數(shù)5×105cells。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

使用活性氧檢測(cè)試劑盒(Beyotime)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[11]，用熒光酶標(biāo)儀(BioTek)測(cè)定吸收波長(zhǎng)525 nm處的 OD 值，以此來(lái)表征細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中抗壞血酸對(duì)mESCs老化狀態(tài)和胞內(nèi)ROS水平的影響

鑒于細(xì)胞發(fā)生老化時(shí)，胞內(nèi)SA-β-Gal活性明顯上升，采用動(dòng)態(tài)微載體懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)mESCs 10 d，每2天取樣定量檢測(cè)SA-β-Gal酶活力[圖1(a)]，并對(duì)培養(yǎng)8 d的mESCs 胞內(nèi)SA-β-Gal活性進(jìn)行定性分析[圖1(b)]。從圖1(a)中可以看出，對(duì)照組從第6天起mESCs胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力與0 d相比有顯著上升(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)到第10天時(shí)胞內(nèi)的SA-β-Gal酶活力才出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)；同時(shí)，在培養(yǎng)6～10 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組的SA-β-Gal酶活力均低于對(duì)照組。此外，從圖1(b)中也可以看出，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行到第8天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色呈藍(lán)色的細(xì)胞明顯少于對(duì)照組。可見(jiàn)，添加抗壞血酸延緩了培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生老化的時(shí)間。

(a)mESCs單位細(xì)胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力測(cè)定(與0 d比較，*P<0.05，**P<0.01)；(b)mESCs的SA-β-Gal活性染色(100×，8 d)

進(jìn)一步檢測(cè)培養(yǎng)6～10 d期間mESCs胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，實(shí)驗(yàn)組mESCs胞內(nèi)ROS水平均低于對(duì)照組，兩組之間8～9 d時(shí)呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)?？梢?jiàn)，添加抗壞血酸后顯著降低了培養(yǎng)過(guò)程中mESCs胞內(nèi)ROS水平。

*表示和對(duì)照組比較P<0.05

2.2 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中抗壞血酸對(duì)mESCs擴(kuò)增特性的影響

mESCs在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的擴(kuò)增情況如圖3所示。從圖3(a)中可以看出，培養(yǎng)第6天時(shí)實(shí)驗(yàn)組的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，而在第8天時(shí)，兩組的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)之間呈現(xiàn)極顯著差異，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞最大擴(kuò)增倍數(shù)為53.9±1.5，極顯著高于對(duì)照組的41.3±0.9(P<0.01)。從圖3(b)細(xì)胞形態(tài)觀察中也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第8天時(shí)實(shí)驗(yàn)組中空載微載體數(shù)量少，且微載體上細(xì)胞量要多于對(duì)照組，而到第10天時(shí)，兩組均出現(xiàn)了聚集體渙散的情況?？梢?jiàn)，添加抗壞血酸促進(jìn)了mESCs在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下的擴(kuò)增。

(a)mESCs的擴(kuò)增倍數(shù)(與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01);(b)mESCs形態(tài)鏡檢視野(100×)

培養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)物中SSEA-1+細(xì)胞比例的變化[圖4(a)、(b)]，并計(jì)算其擴(kuò)增倍數(shù)[圖4(c)]。從圖4(b)中可以看出，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的SSEA-1+細(xì)胞比例沒(méi)有顯著差異；從圖4(c)中可以看出，培養(yǎng)到第8 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組的SSEA-1+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)到51.9±6.3，極顯著高于對(duì)照組的40.1±3.9(P<0.01)。說(shuō)明添加抗壞血酸有利于促進(jìn)SSEA-1+細(xì)胞的擴(kuò)增。

(a)SSEA-1+細(xì)胞比例流式分析圖；(b)SSEA-1+細(xì)胞比例；(c)SSEA-1+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(和對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01)

為了評(píng)價(jià)擴(kuò)增后mESCs的全能性，對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行AKP活性、OCT-4蛋白免疫熒光染色及Sox2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的全能性指標(biāo)檢測(cè)。從結(jié)果(圖5)可以看出，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組所培養(yǎng)細(xì)胞的AKP染色均呈現(xiàn)深紫紅色[圖5(a)]，為AKP高活性；且OCT-4均呈陽(yáng)性表達(dá)[圖5(b)]，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞仍具有mESCs的標(biāo)志。進(jìn)一步檢測(cè)培養(yǎng)所獲得細(xì)胞中mESCs特異性表達(dá)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達(dá)水平，從圖5(c)的RT-PCR凝膠電泳圖可以看出兩組培養(yǎng)獲得的細(xì)胞中Sox2均呈陽(yáng)性表達(dá)，兩組細(xì)胞Sox2的條帶面積均和看家基因GAPDH的相比形成半定量分析圖[圖5(e)]，實(shí)驗(yàn)組Sox2相對(duì)表達(dá)量和對(duì)照組的相比[圖5(d)]落在0.5～2.0倍線之間，無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，兩種條件下培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞均保有mESCs全能性標(biāo)記。

3 討論

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生老化時(shí)，溶酶體膨脹、增多，位于溶酶體中的β-半乳糖苷酶隨之增多[12]，因此測(cè)定SA-β-Gal活性來(lái)表征mESCs老化情況[圖1(a)、(b)]。在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系中添加抗酸血酸后，培養(yǎng)過(guò)程中胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力顯著升高的時(shí)間從培養(yǎng)6 d延遲到了10 d[圖1(a)]，表明抗壞血酸延緩了細(xì)胞出現(xiàn)老化的時(shí)間。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)6～10 d實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)ROS水平均低于對(duì)照組，兩組之間在培養(yǎng)8～9 d時(shí)呈顯著性差異(圖2)，表明添加抗壞血酸后，顯著降低了胞內(nèi)ROS水平。這與目前文獻(xiàn)[13-16]所報(bào)道的抗壞血酸具有調(diào)節(jié)ROS水平的作用一致。鑒于細(xì)胞老化發(fā)生原因之一普遍被認(rèn)為是自由基損傷所導(dǎo)致[5-6]，因此，結(jié)果提示培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞老化狀態(tài)與細(xì)胞內(nèi)ROS水平之間存在對(duì)應(yīng)聯(lián)系。

從圖3(b)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的mESCs的擴(kuò)增效果看，添加抗壞血酸后培養(yǎng)體系中空載微載體的數(shù)量減少；由圖3(a)可知，培養(yǎng)到8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組mESCs的擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)53.9±1.5，顯著高于對(duì)照組的41.3±0.9。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間mESCs表面特異性抗原SSEA-1+細(xì)胞的比例沒(méi)有顯著差別[圖4(b)]，培養(yǎng)8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組的SSEA-1+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)51.9±6.3，顯著高于對(duì)照組的40.1±3.9[圖4(c)]。從mESCs的干性指標(biāo)分析結(jié)果可以看出，兩種條件下培養(yǎng)所獲得細(xì)胞均保有mESCs全能性標(biāo)記[圖5(a)至(e)]?？梢?jiàn)，添加抗壞血酸有利于mESCs的體外擴(kuò)增。

(a)mESCs內(nèi)AKP染色鏡檢視野(100×，8 d)；(b)mESCs內(nèi)OCT-4蛋白的免疫熒光染色鏡檢視野(100×，8 d)；(c)mESCs中Sox2基因的RT-PCR凝膠電泳視野；(d)mESCs中Sox2基因的相對(duì)表達(dá)量(和對(duì)照組相比)；(e)mESCs中Sox2基因的半定量分析(與GAPDH相比)

在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系中，通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中不斷向培養(yǎng)液添加抗壞血酸，可顯著降低胞內(nèi)ROS水平，明顯改善mESCs老化狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)mESCs的體外擴(kuò)增。研究結(jié)果為解決胚胎干細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞老化問(wèn)題提供了一種解決思路。