王一祺 修文超 徐明

(山東大學齊魯醫(yī)院(青島)肛腸科，山東 青島 266002)

結腸癌是發(fā)病率和死亡率均較高的常見惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過程受多基因、多階段的復雜調(diào)控，所以從分子層面精準靶向醫(yī)療可有效提高結腸癌的療效，對其預防和早期診斷也具有重要意義〔1〕。miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在結腸癌患者中表達失衡，參與癌癥的發(fā)生和進展過程，是結腸癌早期診斷、預后預測的潛在分子生物學標志物和治療靶點〔2〕。miR-203a-3p通過抑制鼻咽癌中的LIM和SH3結構域蛋白(LASP)1抑制細胞增殖和轉移〔3〕；miR-203a-3p可通過下調(diào)靶基因蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉移酶(PRMT)5的表達抑制胃癌細胞增殖〔4〕；lncRNA HOTAIR通過上調(diào)miR-203a-3p的表達水平和Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路的活性來抑制結腸癌增殖，降低化學耐藥性〔5〕。Jun二聚化蛋白(JDP)2是一種參與組蛋白乙酰化的轉錄因子，其通過改變?nèi)旧|(zhì)結構調(diào)控基因轉錄進而在細胞的生理或病理活動中發(fā)揮功能作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)JDP2是一種新的抑癌因子，通過多種途徑抑制惡性腫瘤的早期侵襲和轉移，JDP2可通過不同通路抑制人胰腺癌上皮向間質(zhì)轉化〔7〕。但miR-203a-3p調(diào)控JDP2基因?qū)Y腸癌細胞生物學行為的影響還未有報道，本研究探討miR-203a-3p調(diào)控JDP2對結腸癌細胞的生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌細胞SW480、SW620、LOVO、HT29和人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460購自中國科學院上海細胞庫；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒購自Sigma公司；Matrigel膠、Transwell小室購于美國BD公司；放射免疫沉淀測定(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗兔IgG二抗、兔源β-actin、JDP2、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、周期蛋白依賴性激酶(CDK)1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) SW480、SW620、LOVO、HT29和NCM460細胞均采用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)孵育，培養(yǎng)箱設置為37 ℃、含5% CO2、飽和濕度。

1.3轉染與分組 將80%融合的對數(shù)期HT29細胞(接種96孔板)用無血清RPMI1640同步化12 h，隨后按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。根據(jù)轉染序列片段和質(zhì)粒的不同分為miR-203a-3p組、miR-con組(轉染miR-con)、anti-miR-203a-3p組、anti-miR-con組、pcDNA組、pcDNA-JDP2組、anti-miR-203a-3p+si-con組、anti-miR-203a-3p+si-JDP2組。

1.4qRT-PCR檢測miR-203a-3p和JDP2 mRNA表達水平 Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度和濃度合格后，按照反轉錄試劑盒合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參按照熒光定量試劑盒使用說明進行qRT-PCR。采用2-△△Ct法計算miR-203a-3p和JDP2 mRNA相對表達量。

1.5Western印跡檢測蛋白的表達 在RIPA裂解液中裂解各組HT29細胞，蛋白定量后每組取50 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE，利用濕法轉膜裝置并轉膜，設置電流為300 mA、時間30 min。5%脫脂奶粉封閉膜后。在4℃下加入1∶1 000稀釋一抗孵育膜過夜；室溫條件下加入1∶2 000稀釋二抗孵育2 h。隨后進行暗室顯影、定影。Quantity One軟件用于檢測蛋白條帶灰度值，JDP2、CyclinD1、CDK1、MMP-2、MMP-9蛋白與β-actin的灰度值之比即目的蛋白表達水平。

1.6MTT檢測細胞增殖 在96孔板培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的每孔HT29細胞中補充20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后用二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體，酶標儀測定吸光度(A)值，波長為490 nm。實驗組與空白對照組的A值百分比計算細胞活性(%)。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 調(diào)整各組HT29細胞濃度為2×104個/ml無血清RPMI1640。取4×103個細胞加入Transwell上室(侵襲實驗時包被基質(zhì)膠，遷移實驗時未包被)。取500 μl完全培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定穿膜HT29細胞，30 min后用0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察、統(tǒng)計，以隨機選取5個視野的平均值表示侵襲或遷移細胞數(shù)。

1.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測 miR-203a-3p 對JDP2的靶向調(diào)控構建含miR-203a-3p結合位點的JDP2野生型(WT)或突變型(MUT)3′UTR-熒光素酶表達載體(JDP2-WT和JDP2-MUT)，用LipofectamineTM2000將JDP2-WT和JDP2-MUT分別與miR-con、miR-203a-3p共轉染。熒光素酶報告基因檢測儀測定轉染48 h各組HT29細胞熒光素酶活性和Renilla活性，實驗結果以二者的比值表示。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-203a-3p和JDP2在人正常結腸黏膜上皮細胞株與結腸癌細胞中的表達 SW480、SW620、LOVO、HT29細胞中miR-203a-3p的表達較NCM460細胞顯著增加，JDP2 mRNA和JDP2蛋白表達較NCM460細胞顯著減少(均P<0.05)。見表1和圖1。結腸癌細胞中miR-203a-3p高表達，JDP2低表達；選擇表達差異最顯著的HT29細胞用于后續(xù)實驗。

表1 miR-203a-3p和JDP2在NCM460、SW480、SW620、LOVO、HT29細胞中的表達

圖1 各組JDP2蛋白表達

2.2干擾miR-203a-3p對HT29細胞增殖影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-203a-3p組HT29細胞中miR-203a-3p的表達水平、細胞活性、CDK1和CyclinD1蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 檢測HT29細胞中CDK1和CyclinD1的表達

表2 干擾miR-203a-3p表達對HT29細胞增殖的影響

2.3干擾miR-203a-3p對HT29細胞遷移侵襲和遷移相關蛋白表達的影響 anti-miR-203a-3p組HT29細胞的遷移及侵襲數(shù)量較anti-miR-con組顯著降低約65.02%和63.35%(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平較anti-miR-con組顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3、4。

表3 干擾 miR-203a-3p對HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達的影響

圖3 兩組HT29細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

1～2：anti miR-con組，anti-miR-203a-3p組圖4 兩組MMP-2和MMP-9的表達

2.4miR-203a-3p對JDP2的靶向作用軟件TargetScan對miR-203a-3p與JDP2之間的靶向結合預測結果 見圖5。結腸癌HT29細胞的熒光素酶活性在miR-203a-3p組與JDP2-WT載體共轉染后顯著低于miR-con組(P<0.05)；而其在miR-203a-3p組與JDP2-MUT載體共轉染后無明顯變化(P>0.05)，見表4。miR-203a-3p組結腸癌HT29細胞中JDP2的表達水平(0.11±0.02)較miR-con組(0.24±0.06)顯著降低；anti-miR-203a-3p組結腸癌HT29細胞中JDP2的表達水平(0.63±0.05)較anti-miR-con組(0.26±0.04)顯著升高(P<0.05)，見圖6。

圖5 JDP2的3'UTR中含有與miR-203a-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-con組,miR-203a-3p組,anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組圖6 結腸癌HT29細胞中JDP2的表達

2.5過表達JDP2抑制HT29細胞增殖、遷移和侵襲 與pcDNA組相比，pcDNA-JDP2組HT29細胞活性、細胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著降低(均P<0.05)，JDP2的表達水平顯著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖7、表5。

2.6沉默JDP2表達部分逆轉干擾miR-203a-3p對HT29細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與anti-miR-203a-3p+si-con組相比，anti-miR-203a-3p+si-JDP2組HT29細胞活性顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)，JDP2的表達水平顯著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表6、7，圖8。

1～2：pcDNA組,pcDNA-JDP2組圖7 各組HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白表達

表5 過表達JDP2表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲及HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白的作用

表6 anti-miR-203a-3p和JDP2表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的作用

表7 anti-miR-203a-3p和JDP2表達對HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白的作用

1～4：anti-miR-con組,anti-miR-203a-3p組,anti-miR-203a-3p+si-con組,anti-miR-203a-3p+si-JDP2組圖8 各組檢測HT29細胞增殖相關蛋白和遷移相關蛋白

3 討 論

上皮-間質(zhì)轉化(EMT)在腫瘤的原位浸潤和遠處轉移扮演重要角色〔8〕，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可參與調(diào)控EMT的過程，進而影響腫瘤的侵襲及轉移〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-203a通過負向靶向同源異形盒基因家族成員(HOX)D3和抑制通過血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)途徑的細胞信號傳導來抑制肝細胞癌細胞侵襲、轉移和血管生成〔10〕；肝細胞外泌體miR-203a-3p可誘導結腸癌細胞間充質(zhì)-上皮細胞轉化〔11〕。過表達miR-203可降低結腸癌細胞的侵襲及遷移能力〔12〕；此外，miR-203可能通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基(P110α)、蛋白激酶B(AKT)1、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)2基因的表達調(diào)節(jié)結腸癌癌細胞增殖和轉移〔13〕。與鄰近的正常組織相比，miR-203a-3p在結腸癌組織中上調(diào)表達，通過靶向磷酸二酯酶(PDE)4D促進結腸癌的增殖和遷移〔14〕。本研究提示miR-203a-3p在結腸癌細胞中表達水平顯著升高，干擾miR-203a-3p表達可降低HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力；下調(diào)CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平且miR-203a-3p可靶向調(diào)控JDP2的表達。

JDP2是轉錄因子的活化蛋白(AP)-1家族的成員，也是AP-1的抑制劑；JDP2過表達抑制AP-1信號傳導保護心肌細胞免于肥大和凋亡誘導〔15〕；JDP2缺乏會促進心臟肥大和對壓力超負荷的功能障礙〔16〕。JDP2的高表達與肝癌患者的生存率相關，可作為肝癌的腫瘤抑制劑〔17〕；miR-501通過靶向JDP2促進肝細胞癌的EMT〔18〕。而JDP2過表達可引起小鼠心臟功能障礙〔19〕；JDP2通過p16Ink4a-pRb和Arf-p53途徑控制缺氧誘導的復制衰老〔20〕。而且JDP2還能促進神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化，此過程中CyclinD1表達水平降低〔21〕。本研究提示JDP2在結腸癌細胞中的水平減少，過表達JDP2可下調(diào)CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，并降低HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力且干擾miR-203a-3p抑制HT29細胞生物學行為的結果被沉默JDP2表達所逆轉。

綜上，干擾miR-203a-3p可通過上調(diào)JDP2的表達抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，miR-203a-3p/JDP2途徑可能是結腸癌的預防、早期診斷、治療和預后預測的新靶點。