高國(guó)強(qiáng) 馮亞男 崔華峰

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院，山東 滕州 277599；2滕州市中醫(yī)醫(yī)院；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科)

腦卒中是臨床中常見的腦血管疾病，致殘率與致死率高，對(duì)神經(jīng)功能造成傷害，影響患者日后正常生活，有效促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)是目前臨床亟待解決的問題〔1,2〕。電針刺激是指在刺入人體穴位的毫針上，用電針機(jī)通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。研究顯示電針刺激對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)有幫助〔3〕，但其機(jī)制尚未完全清楚。SIRT1是最早在酵母中發(fā)現(xiàn)的一種可調(diào)控壽命基因，研究顯示其在神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)，miR-34a分子主要表達(dá)于腦組織，可調(diào)控SIRT1參與一系列生理病理活動(dòng)〔5〕。因此本研究構(gòu)建大鼠大腦動(dòng)脈閉塞模型，并基于miR-34a/SIRT1通路探討電針刺激對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠50只，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，專用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、水喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2014-0012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0002。大鼠均于室內(nèi)通風(fēng)柜中飼養(yǎng)，手術(shù)前1 d晚上禁食。環(huán)球牌針灸針(直徑0.25 mm，長(zhǎng)度30 mm)購(gòu)自豪嘉醫(yī)療器械專營(yíng)店，華佗牌SDZ-Ⅱ型針灸治療儀購(gòu)自重慶美樂醫(yī)療器械有限公司。Trizol試劑盒(12183555)、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(12574018)、蛋白提取試劑盒(AM1556)、BCA試劑盒(23227)購(gòu)自賽默飛世爾中國(guó)公司；鼠抗人SIRT1抗體(ab17193)購(gòu)自美國(guó)abcam公司；GAPDH(sc-47724)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組、造模及處理 將大鼠分為正常組、模型組、假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組。除正常組外，均參照文獻(xiàn)〔6〕左側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓閉塞法制作，構(gòu)建腦卒中大鼠模型。在大鼠頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，將尼龍線(直徑0.2 mm)順勢(shì)緩慢插入大腦中動(dòng)脈，栓塞大腦中動(dòng)脈起始端的血流，然后以尼龍線結(jié)扎頸總動(dòng)脈。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠蘇醒后右側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；提尾倒懸時(shí)右上肢向胸前屈曲；行走時(shí)右側(cè)傾倒或向右轉(zhuǎn)圈；左側(cè)出現(xiàn)霍納征。排除標(biāo)準(zhǔn)：造模不成功；中途死亡。模型制備成功后，將假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠固定，待大鼠安靜后，電針組于每天上午9∶00～11∶00對(duì)大鼠百會(huì)穴、大椎穴〔7〕進(jìn)行電針處理，頻率2 Hz，強(qiáng)度3 mA，時(shí)間20 min，刺激前經(jīng)行皮膚消毒，干涉21 d。假電針刺激組于每天上午9∶00～11∶00行假電針干涉21 d(僅將針插入穴位，不給予電刺激)。假穴位刺激組于每天上午9∶00～11∶00將電針插入穴位右側(cè)1 cm處，給予電刺激，同電針處理。

1.2.2平衡木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、14、21天分別測(cè)定運(yùn)動(dòng)整合及協(xié)調(diào)能力，平衡木長(zhǎng)80 cm，寬2.5 cm，平放在距離地面高10 cm處，術(shù)前1 w每天早晚各訓(xùn)練1次,每次10 min,使其能順利在平衡木上行走，按Feeney 5級(jí)計(jì)分〔8〕標(biāo)準(zhǔn)0分，可正常穿過平衡木；1分，穿過平衡木，但小于一半的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象；2分，穿過平衡木，但有大于50%的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象；3分，可穿過平衡木，但癱瘓側(cè)后肢拖行；4分，無(wú)法穿過平衡木，但可在平衡木上保持平衡；5分，將大鼠放在平衡木上會(huì)掉下來(lái)。

1.2.3抓握牽引試驗(yàn) 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、7、14、21天分別進(jìn)行抓握牽引試驗(yàn)，將直徑0.15 mm的鋼絲繩置于距離地面70 cm固定，下面放厚5 cm的海綿墊以防大鼠摔傷。將大鼠兩個(gè)前爪放鋼絲繩上，記錄大鼠懸掛時(shí)間〔9〕。0分，掛在繩上0～2 s；1分，掛在繩上3～4 s；2分，掛在繩上5 s；3分，掛在繩上超過5 s。

1.2.4神經(jīng)功能缺損評(píng)分的監(jiān)測(cè) 末次刺激結(jié)束后，參照文獻(xiàn)方法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分〔10〕：0分，無(wú)神經(jīng)功能障礙；1分，右前爪無(wú)法充分外展；2分，走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向右傾倒；4分，無(wú)法自主行走，出現(xiàn)意識(shí)障礙。

1.2.5大鼠腦組織梗死比測(cè)量 各組大鼠末次刺激結(jié)束后，隨機(jī)抽取5只，快速斷頭取腦，冰凍20 min后去除小腦及低位腦干，從額極至枕極做2 mm連續(xù)冠狀切片，將切片置于2%的2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染液中，37℃避光育30 min，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中固定，正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色，用眼科鑷仔細(xì)分離白色區(qū)與紅色區(qū)，參照文獻(xiàn)〔7〕方法分別稱重，計(jì)算梗死區(qū)占全腦的百分比作為梗死比〔11〕，梗死比(%)=白色區(qū)重量/(白色區(qū)重量+紅色區(qū)重量)/100%。剩余各組大鼠分離腦組織，一部分經(jīng)固定、脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化情況；另一部分儲(chǔ)存于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)血清miR-34a水平 按照Trizol試劑盒操作說明提取1.2.5液氮中腦組織標(biāo)本中總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒行qRT-PCR檢測(cè)miR-34a表達(dá)水平，PCR條件：95℃預(yù)熱10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-34a相對(duì)表達(dá)量。正向引物：5′-GGGAAUAGU-AGCUGUCAAATT-3′，反向引物：5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；miR-34a正向引物:5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向引物：5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7免疫印跡法檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá) 取1.2.5液氮中各組大鼠適量腦組織，RIPA裂解液裂解，充分裂解后4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量。取一定量蛋白質(zhì)，加入上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，離心后取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶37℃封閉2 h。加入SIRT1一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，清洗PVDF膜后，加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液避光顯影。Image J圖像軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組平衡木試驗(yàn)評(píng)分比較 正常組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組平衡木試驗(yàn)評(píng)分于術(shù)后3 d達(dá)最頂峰，隨后下降，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分依次降低；與正常組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分均顯著下降(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評(píng)分均顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.2各組肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分比較 正常組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分于術(shù)后3 d達(dá)最低谷，隨后上升；假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組術(shù)后1 d、3 d、14 d、21 d肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分依次升高。與正常組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分均顯著升高(P<0.05)；與假電針刺激組相比，假穴位電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分均顯著升高(P<0.05)；與假穴位電針刺激組相比，電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組平衡木試驗(yàn)評(píng)分、腦組織神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織梗死比比較

表2 各組肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分及腦組織miR-34a、SIRT1蛋白表達(dá)比較

2.3各組神經(jīng)功能評(píng)分 正常組無(wú)神經(jīng)功能缺損。與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.4各組腦組織梗死比比較 正常組腦組織無(wú)梗死。與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織梗死比顯著降低(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織梗死比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組腦組織梗死比顯著下降。見表1。

2.5各組腦組織病理學(xué)改變 正常組腦組織結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常，神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則。模型組腦組織結(jié)構(gòu)不清、組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)著色灰暗、胞核稍增大，染色深。假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組神經(jīng)細(xì)胞部分恢復(fù)，且電針刺激組好于假電針刺激組與假穴位電針刺激組。見圖1。

2.6各組腦組織miR-34a及SIRT1蛋白表達(dá) 與正常組相比，模型組腦組織miR-34a水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織miR-34a、SIRT1蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比，電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

箭頭代表神經(jīng)細(xì)胞圖1 各組腦組織病理切片(HE，×200)

1～5：正常組，模型組，假電針刺激組，假穴位電針刺激組，電針刺激組圖2 各組腦組織SIRT1蛋白

3 討 論

電針刺激是中醫(yī)學(xué)中針灸的一種療法，具有針灸和電療的雙重特點(diǎn)，其療效及安全性已經(jīng)過驗(yàn)證。普遍認(rèn)為針刺鎮(zhèn)痛是一個(gè)生理性調(diào)整過程，是痛覺傳入信號(hào)與穴位傳入在中樞神經(jīng)系統(tǒng)能相互作用的結(jié)果，神經(jīng)、體液因素在其中發(fā)揮重要作用〔12，13〕。研究顯示，通過對(duì)大鼠迷走神經(jīng)進(jìn)行電刺激可部分恢復(fù)大鼠中動(dòng)脈阻斷/再灌注損傷大鼠腦損傷〔14〕。Shi等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，電針刺激可改善缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗體積，降低腦組織中的炎癥因子及興奮性氨基酸的水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示成功構(gòu)建腦卒中大鼠模型，電刺激、穴位刺激及電針刺激均對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能具有一定的恢復(fù)作用，而電針刺激療效遠(yuǎn)好于假電針刺激與假穴位電針刺激，提示電針刺激對(duì)保護(hù)動(dòng)脈閉塞大鼠神經(jīng)功能，部分恢復(fù)梗死比具有優(yōu)越性，這可能由于電針刺激具有改善神經(jīng)的傳導(dǎo)功能、促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)等功能，可改善神經(jīng)組織的微血管環(huán)境，能增加脊髓和外周神經(jīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，從而提高患者痛閾、增加疼痛的耐受力、降低疼痛的敏感性〔16〕。

miR-34a是位于染色體1p36，主要表達(dá)于腦組織〔17〕。周成芳等〔18〕研究顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷模型中腦組織miR-34a水平異常升高。研究表明，SIRT1是miR-34a的靶蛋白，miR-34a可調(diào)控SIRT1參與阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔19〕。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙?；?，具有延緩細(xì)胞衰老的作用〔5〕。近年來(lái)，SIRT1的神經(jīng)保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注，Carloni等〔20〕研究顯示，腦缺血再灌注損傷過程中，SIRT1可通過抑制p53和核因子(NF)-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡保護(hù)神經(jīng)損傷。趙秀芹等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酚注射液通過上調(diào)SIRT1表達(dá)減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。本研究表明電針刺激顯著降低miR-34a，促進(jìn)SIRT1蛋白表達(dá)，提示電針刺激可能通過協(xié)同激活miR-34a/SIRT1通路改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能。

綜上所述，電針刺激可能通過激活miR-34a/SIRT1通路，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，本研究也存在一定不足，電針刺激恢復(fù)大鼠神經(jīng)功能的相關(guān)通路有待進(jìn)一步探討。