楊 茜，徐永強(qiáng)，臧園園，陳志剛，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095;2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050)

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，過(guò)量的重金屬離子釋放進(jìn)入水體從而導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題［1］。重金屬具有較高的毒性和致癌性，且無(wú)法生物降解，可通過(guò)食物鏈進(jìn)行生物富集，最終威脅人類健康［2］。壇紫菜是一種集中養(yǎng)殖在近海海域的可食藻類，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，在全世界范圍內(nèi)被廣泛銷售與食用［3］，但是壇紫菜的細(xì)胞壁中多糖和蛋白質(zhì)所攜帶的羧基、硫酸根和磷酸根是優(yōu)異的重金屬結(jié)合位點(diǎn)，具有很強(qiáng)的吸附能力，重金屬超標(biāo)情況十分嚴(yán)峻［4－5］，所以對(duì)壇紫菜進(jìn)行重金屬治理顯得尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藻類中重金屬的脫除研究較少，主要是采用化學(xué)法進(jìn)行去除，包括利用有機(jī)酸(檸檬酸、醋酸)、無(wú)機(jī)酸(鹽酸)、堿液、乙醇等［6－8］，以及超聲輔助法［9－10］。綜合考慮去除效果、安全性和環(huán)保性，開發(fā)出更加綠色、高效的洗脫劑具有重大意義。

天然低共熔溶劑(NADESs)是一種綠色、可持續(xù)溶劑，在化工、醫(yī)藥及生物方面已有廣泛的應(yīng)用［11－14］。NADESs是指在合適溫度下混合一定摩爾比的天然產(chǎn)物原料作為氫鍵供體和氫鍵受體并且在室溫下為液態(tài)的低共熔混合物［15－16］，它具有合成方便、成本低、原料易獲得、毒性低且性質(zhì)可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)［11］。現(xiàn)階段NADESs更多地被用于土壤和污水中的重金屬去除［17－20］，研究表明NADESs可以通過(guò)攻擊富含電子對(duì)的有機(jī)碳位來(lái)釋放土壤中的鉛離子，且在進(jìn)行洗滌后土壤沒(méi)有發(fā)生腐蝕或礦物質(zhì)變化，同時(shí)，NADESs易溶于水，可以很好地與洗滌后的樣品進(jìn)行分離［18］。然而，NADESs從未被用作從藻類食品中去除污染物的洗脫劑。本研究通過(guò)加熱的方法制備了28種不同基質(zhì)的NADESs，通過(guò)洗滌的方式對(duì)壇紫菜進(jìn)行了重金屬去除，同時(shí)研究了NADESs與表面活性劑的協(xié)同去除效果，并且分析了重金屬去除前后壇紫菜中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和質(zhì)構(gòu)的變化，為NADESs去除紫菜中重金屬提供了理論依據(jù)，也為NADESs在其他食品中的應(yīng)用提供了一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10023 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;Pb、Cd、Cr、As、Cu五種標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(1000 mg/L) 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;氯化膽堿(≥98.0%)、D－(+)－木糖、蔗糖、D－(+)－葡萄糖(≥99.5%)，果糖、山梨糖、甘露糖、D－(+)－半乳糖、L－(+)－阿拉伯糖、L－(+)－鼠李糖、海藻糖、木糖醇、山梨醇、甘油、L－脯氨酸、L－丙氨酸、甘氨酸、L－組氨酸、L－賴氨酸、L－精氨酸(≥99.0%)、1，2－丙二醇、乙二醇、1，6－己二醇、皂素、甜菜堿(均為分析純)，十二烷基硫酸鈉、阿拉伯樹膠(醫(yī)藥級(jí))均購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;大豆分離蛋白 恒天然(上海)有限公司;硝酸(優(yōu)級(jí)純)上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸 南京化學(xué)試劑有限公司;苯酚、無(wú)水葡萄糖(分析純)、牛血清蛋白，考馬斯亮藍(lán)、石油醚 南京杰汶達(dá)生物科技有限公司。

ICP－OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;MARS5 XP1600微波消解儀 美國(guó)CEM公司;09C20趕酸儀 上海博通化學(xué)科技有限公司;NUT－Ⅱ－5T超純水處理系統(tǒng) 南京優(yōu)普實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UP型超聲清洗儀 南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司;SHZ－82A水浴恒鍋 金壇市科析儀器有限公司;G16－WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;TLP質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)FTC公司;UV BlueStar A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)萊伯泰科有限公司;PQ001低場(chǎng)核磁共振儀 上海紐邁電子科技有限公司;NDJ－9S數(shù)顯黏度計(jì) 上海平軒科學(xué)技術(shù)有限公司;HPG－2132便攜式色差儀 上海漢譜光電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NADESs的制備 按照表1的摩爾比例準(zhǔn)確稱取氫鍵受體與氫鍵供體，通過(guò)攪拌兩組分，并在適宜的溫度下加熱(90～100℃)直至形成均一、穩(wěn)定的液體。冷卻至室溫，放置于干燥器中直至恒重。

1.2.2 NADESs去除壇紫菜中重金屬效果研究

1.2.2.1 NADESs去除壇紫菜重金屬的方法 將80℃烘干4 h的紫菜樣品與水按照1∶50的固液比進(jìn)行混合，使其充分吸水溶脹，隨后轉(zhuǎn)速8000 r/min，離心30 min，棄上清計(jì)算吸水率。

將紫菜樣品與NADESs按照1∶10進(jìn)行混合，渦旋使其混合均勻后放入60℃水浴鍋中恒溫1 h。此間，每隔15 min在(40±1)℃的條件下超聲功率100 W，超聲5 min。隨后轉(zhuǎn)速8000 r/min，離心10 min，棄上清。再分別加入等體積超純水，轉(zhuǎn)速8000 r/min，離心10 min，取沉淀。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以等體積的水為對(duì)照組。

1.2.2.2 壇紫菜中重金屬測(cè)定方法 經(jīng)去除處理后的紫菜樣品，每份加入8 mL優(yōu)級(jí)純濃硝酸，靜置消化過(guò)夜，用微波消解儀消解充分，消解條件參考表2，消解完成后于趕酸儀上進(jìn)行趕酸處理，直至約剩0.5～1 mL的溶液;后定容于25 mL容量瓶，0.45μm水系微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

參考GB 5009.268－2016《食品中多元素的測(cè)定》，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定樣品液中鉛、鎘、鉻、銅及總砷含量，并計(jì)算去除率。

1.2.3 NADESs去除重金屬條件優(yōu)化 根據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇一種NADES進(jìn)行紫菜中重金屬脫除單因素條件優(yōu)化。

1.2.3.1 GlyAla的濃度對(duì)紫菜中重金屬去除效果影響 選擇去離子水對(duì)GlyAla進(jìn)行稀釋，分別稀釋至0%、10%、20%、30%、40%的含水量，按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除并測(cè)定不同含水量的GlyAla處理后壇紫菜中的重金屬含量。

表1 天然低共熔溶劑組分及比例Table 1 List of NADESs prepared from natural products

表2 MARS6 XP 1600微波輔助消解系統(tǒng)程序Table 2 The program of MARS6 XP 1600 microwave－assisted digestion system

1.2.3.2 固液比對(duì)紫菜中重金屬去除效果影響 根據(jù)1.2.3.1中的結(jié)果，選擇重金屬去除率較高的含水量為最適條件，調(diào)整固液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除并測(cè)定不同固液比處理后壇紫菜中的重金屬含量。

1.2.4 NADESs與表面活性劑協(xié)同去除紫菜中重金屬

1.2.4.1 表面活性劑對(duì)紫菜中重金屬的去除 選取5種不同類型的表面活性劑為代表，分別是為:陽(yáng)離子表面活性劑:皂素(Saponin);陰離子表面活性劑:十二烷基硫酸鈉(SDS);兩性離子表面活性劑:甜菜堿(Betaine);多糖類表面活性劑:阿拉伯樹膠(AG)及蛋白類表面活性劑:大豆分離蛋白(SPI)，均配制為濃度1%(v/v)的表面活性劑溶液，按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除并測(cè)定不同表面活性劑處理后壇紫菜中的重金屬含量。

1.2.4.2 表面活性劑與NADESs協(xié)同去除紫菜中重金屬效果研究 根據(jù)1.2.4.1結(jié)果，選擇重金屬去除率較高的表面活性劑作為研究對(duì)象，與重金屬去除率較低的NADESs(6種)按照體積比1∶9進(jìn)行混合，保持固液比1∶20按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除并測(cè)定協(xié)同處理后壇紫菜中的重金屬含量。

1.2.4.3 表面活性劑含量對(duì)紫菜中重金屬去除影響 根據(jù)1.2.4.2結(jié)果，選擇協(xié)同效果較好的組分進(jìn)行優(yōu)化，分別將表面活性劑含量為0、10%、20%、30%、40%和50%(v/v)的NADESs，保持固液比1∶20按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除并測(cè)定不同表面活性劑含量處理后壇紫菜中的重金屬含量。

1.2.5 NADESs去除重金屬對(duì)紫菜品質(zhì)的影響 選擇去除效果較好的NADESs在最優(yōu)條件下按照1.2.2中的方法進(jìn)行重金屬去除處理，并測(cè)定去除前后壇紫菜主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其色澤和質(zhì)構(gòu)的變化。

表3 壇紫菜的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criteria for Porphyra haitanensis

1.2.5.1 多糖測(cè)定 精密量取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞試管中，分別加水至1 mL，將標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0、20、40、60、80、100 mg/L。分別精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，后迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置于30℃水浴中保溫20 min，冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白。按照紫外可見(jiàn)光分光光度法，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取樣品0.3 g，精確到0.001 g，于50 mL具塞離心管中。用5 mL去離子水水浸潤(rùn)樣品，然后緩慢加入20 mL無(wú)水乙醇，使用渦旋振蕩器進(jìn)行充分振蕩，使混合均勻，樣品置于超聲波提取器中超聲30 min，提取結(jié)束后，于4000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心，沉淀中加入50 mL水，于120 W超聲提取30 min，重復(fù)兩次，冷卻至室溫，過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，并且將殘?jiān)礈?～3次，洗滌液也轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容。取樣液1 mL置于10 mL比色管中，測(cè)定吸光度。

1.2.5.2 可溶性蛋白測(cè)定 分別吸取0.10 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于10 mL的比色管中，加蒸餾水至1 mL。然后在各支試管中分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液，搖勻，在室溫下反應(yīng)5 min。在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取樣品0.1 g，精確到0.001 g，加入5 mL水搖勻，超聲15 mL，稀釋50倍后取1.5 mL離心，取3支比色管，分別吸取1 mL離心后的上清液，各加5 mL G250考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，在室溫下反應(yīng)5 min。在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5.3 脂肪測(cè)定 準(zhǔn)確稱取樣品5 g，用濾紙包好，抽提6 h，水浴溫度50℃。拿出濾紙包，通風(fēng)櫥中先揮發(fā)殘余的石油醚，105℃干燥至恒重，分別稱取樣品濾紙包抽提前后的重量。

1.2.5.4 色澤測(cè)定 用色差儀測(cè)定紫菜表面的顏色變化，記錄L*(亮度)值、a*(紅度)值、b*(黃度)值，每個(gè)樣品測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5.5 感官評(píng)定 選擇身體健康、無(wú)感官缺陷的評(píng)價(jià)員12名(男生6名，女生6名)，分別以未處理、NADEs處理和對(duì)照組水處理的壇紫菜為研究對(duì)象，按表3標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定。

1.2.5.6 質(zhì)構(gòu)測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)試，以硬度、剪切力、彈性和咀嚼性為指標(biāo)。將濕壇紫菜樣品裝于塑料容器中，樣品高度為0.5 cm，使用P50探頭，測(cè)試前后移動(dòng)速度為5 mm/s，測(cè)試時(shí)的移動(dòng)速度為1 mm/s，測(cè)試距離為0.1 mm，變形量為30%，停留間隔為5 s。每個(gè)樣品測(cè)定10次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 測(cè)定方法

1.2.6.1 壇紫菜中重金屬含量計(jì)算方式 樣品經(jīng)ICP－OES測(cè)定，其測(cè)定值經(jīng)過(guò)下式換算，使之與國(guó)標(biāo)規(guī)定重金屬檢出限單位相同。

式中:c:壇紫菜樣品重金屬含量，mg/kg;c0:樣品測(cè)試液濃度，mg/L;m:壇紫菜樣品質(zhì)量，g;V0:樣品測(cè)試液體積，mL。

1.2.6.2 壇紫菜重金屬去除率計(jì)算方式

式中:r:重金屬去除率，%;c1:洗脫前壇紫菜重金屬含量，mg/kg;c2:洗脫后壇紫菜重金屬含量，mg/kg。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADESs對(duì)壇紫菜中重金屬的脫除效果分析

本次實(shí)驗(yàn)所選取的28種NADESs主要分為兩大類;1～14為氯化膽堿類，15～28為多元醇類。氯化膽堿類又可細(xì)分為氯化膽堿－糖類、氯化膽堿－有機(jī)酸類及氯化膽堿－醇類;多元醇類則可細(xì)分為甘油－氨基酸類、1，2－丙二醇－氨基酸類、乙二醇－氨基酸類及1，6－己二醇－氨基酸類。

不同種類的NADESs對(duì)壇紫菜重金屬的去除效果如圖1所示。圖1A顯示，鉛與壇紫菜的結(jié)合較為牢固，對(duì)照組水對(duì)鉛的去除率僅為6.22%，除了ChSuc之外，其他NADESs的去除率與水相比均顯著提高(P＜0.05)，表現(xiàn)出良好的去除效果。氯化膽堿類的去除效果隨基質(zhì)的不同有明顯差異，去除率最高的是氯化膽堿－有機(jī)酸類(9～11)，去除范圍為74.55%～87.54%，其中ChCit和ChTar的去除率達(dá)到80%以上;其次是氯化膽堿－醇類(12～14)，去除范圍為54.46%～65.32%，氯化膽堿－糖類(1～8)的去除效果受到不同糖類基質(zhì)的影響較大，去除范圍為17.40%～66.21%;多元醇類(15～28)的去除效果差異不大，去除率范圍為45.47%～66.92%。

圖1 不同NADESs(1～28)對(duì)壇紫菜中重金屬Pb(A)、Cd(B)、Cr(C)、As(D)、Cu(E)去除的影響Fig.1 Effects of different NADESs(1～28)on removal of heavy metals Pb(A)，Cd(B)，Cr(C)，As(D)，Cu(E)from P.haitanensis

圖1B顯示了不同種類的NADESs對(duì)壇紫菜中重金屬鎘的去除效果，由圖1B可得，所有NADESs的鎘去除率與對(duì)照組水均存在極顯著差異(P＜0.001)，去除效果均優(yōu)于水。氯化膽堿類(1～14)的鎘去除率普遍優(yōu)于多元醇類(15～28)，其去除范圍為80.72%～100.00%，其中ChCit和ChTar的鎘去除率達(dá)到100%(洗脫后樣品中未檢出鎘)，ChGlu、ChAra、ChRha、ChTre、ChMal、ChSo和ChXy的鎘去除率達(dá)到90%以上;多元醇類的鎘去除率隨基質(zhì)的不同存在差異，去除范圍為57.54%～91.35%，其中多元醇－組氨酸類(18、23和26)的鎘去除效果最佳，均達(dá)到80%以上，EgHis的去除率最高，為91.35%。

圖1C顯示了不同種類的NADESs對(duì)重金屬鉻的去除效果，對(duì)照組水的去除率為10.93%，除了ChXyl和ChFru之外，其他NADESs的去除率與水相比均顯著提高(P＜0.05)，但總體去除效果一般，氯化膽堿類(1～14)的去除效果隨基質(zhì)的不同存在差異，去除范圍為9.80%～43.78%;多元醇類(15～28)的去除效果差異不大，去除范圍為34.44%～48.59%，其中多元醇－脯氨酸類(15、21、24和27)的去除效果最佳，均達(dá)到40%以上，其中GlyPro的去除率最高，為48.59%。

圖1D顯示了不同種類的NADESs對(duì)總砷的去除效果，由圖1D可知，對(duì)照組水的去除率高達(dá)51.72%，而大部分NADESs的去除效果與對(duì)照組水的去除效果相當(dāng)，甚至有些去除率低于水，并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯地去除能力，只有HexGly和HexPro這兩個(gè)1，6－己二醇－氨基酸類NADESs(28和27)以及GlyArg(20)的去除率極顯著高于水(P＜0.001)，分別是77.72%、78.24%和66.95%。

圖1E顯示了不同種類的NADESs對(duì)重金屬銅的去除效果，其中對(duì)照組水的去除率為20.02%，NADESs的去除范圍為11.68%～79.73%，部分NADESs的去除率低于水，且不同基質(zhì)的NADESs的去除率差異較大，有16種氯化膽堿類的去除率極顯著高于水(P＜0.001)，其中氯化膽堿－有機(jī)酸類(9～11)的去除率最高，均高達(dá)70%以上;而多元醇類的NADESs中多元醇－組氨酸類(20、23、26和27)的去除率最高，可達(dá)60%以上。

綜合分析NADESs對(duì)不同重金屬的去除效果發(fā)現(xiàn)，其對(duì)鉛和鎘的去除能力普遍較好，對(duì)鉻的去除能力不佳，對(duì)總砷和銅的去除能力則根據(jù)其基質(zhì)的不同有較大的差異;氯化膽堿類的NADESs中氯化膽堿－有機(jī)酸類(9～11)對(duì)5種重金屬的去除效果均較好，多元醇類的NADESs中多元醇－組氨酸類(18、23和26)則對(duì)鉛、鎘、鉻和銅4種重金屬有良好的去除效果，尤其是鎘和銅。

2.2 NADESs去除壇紫菜中重金屬條件優(yōu)化

2.2.1 GlyAla的含水量對(duì)壇紫菜中重金屬去除效果影響 GlyAla是一種制備時(shí)間短、成本低、具有代表性的常用NADESs，其黏度較高，去除率較低，具有進(jìn)一步優(yōu)化空間，故選擇GlyAla為代表加水稀釋，研究NADESs含水量對(duì)去除效果影響，優(yōu)化壇紫菜中重金屬去除條件。高黏度是NADESs的一個(gè)缺點(diǎn)，這不僅阻礙了物質(zhì)運(yùn)輸，而且導(dǎo)致了處理上的困難［21］。研究表明，添加水會(huì)影響NADESs的黏度和密度，從而改變其對(duì)重金屬的去除效果［16］。

圖2顯示了含水量為0、10%、20%、30%和40%的GlyAla的黏度變化。隨著含水量的增加，GlyAla的黏度不斷降低，當(dāng)含水量為10%時(shí)，混合體系的黏度顯著下降(P＜0.01)，當(dāng)含水量為40%時(shí)，黏度降低到其原始值的1/50。圖3顯示了具有不同含水量的GlyAla的弛豫時(shí)間曲線，反映了液體分子之間的相互作用，在10%的含水量下，弛豫時(shí)間較短，為44～109 ms，表明GlyAla與水之間的相互作用仍然很強(qiáng)。隨著含水量的增加，弛豫時(shí)間不斷增加，這表明GlyAla與水之間的相互作用逐漸減弱。

圖2 不同含水量的GlyAla的黏度Fig.2 The viscosity of GlyAla diluted with different water contents

圖3 不同含水量GlyAla的弛豫時(shí)間Fig.3 Relaxation time for different water content of GlyAla

圖4 顯示了GlyAla含水量對(duì)壇紫菜中重金屬去除效果的影響，結(jié)果表明GlyAla加水稀釋后會(huì)提高五種重金屬的去除率，Cd、Cr、As和Cu在含水量為10%時(shí)達(dá)到最大值，Pb在含水量為20%時(shí)達(dá)到最大，但不會(huì)持續(xù)增加，因?yàn)楹康脑黾訒?huì)降低NADES的黏度并提高傳質(zhì)效率，從而提高重金屬去除率，但NADES的結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響其理化性質(zhì)及其應(yīng)用，過(guò)量的水會(huì)影響NADES化學(xué)鍵的形成并降低重金屬的絡(luò)合能力［11］，從而降低重金屬去除率。綜合五種重金屬的去除效果，選擇10%的含水量為最優(yōu)條件。

圖4 GlyAla含水量對(duì)壇紫菜中重金屬去除效果影響Fig.4 Effects of water content of GlyAla on removal of heavy mentals from P.haitanensis

2.2.2 固液比對(duì)紫菜中重金屬去除效果影響 如圖5所示，隨著天然低共熔溶劑GlyAla添加量的增加，五種重金屬的去除率都增加，Pb、Cr、As和Cu在固液比為1∶20時(shí)達(dá)到最大，Cd在固液比為1∶25時(shí)達(dá)到最大，提高洗脫劑用量會(huì)增加樣品與洗脫劑之間的接觸面積，并且增大重金屬吸附容量，綜合重金屬去除率和經(jīng)濟(jì)效益，選擇含水量為10%且固液比為1∶20為最優(yōu)去除條件，在此條件下，GlyAla對(duì)Pb、Cd、Cr、As和Cu的 去 除 率 分 別 為66.66%、73.6%、44.67%、65.68%和48.55%，比未優(yōu)化前分別提高了28.01%、25.60%、34.95%、35.48%和56.35%。

圖5 固液比對(duì)壇紫菜中重金屬去除效果影響Fig.5 Effects of solid－liquid ratio on removal of heavy mentals from P.haitanensis

2.3 NADESs與表面活性劑協(xié)同去除紫菜中重金屬

2.3.1 表面活性劑對(duì)紫菜中重金屬的去除效果 表面活性劑是一類在添加后可以改變?nèi)芤合到y(tǒng)界面狀態(tài)的物質(zhì)，可以通過(guò)絡(luò)合和離子交換吸附重金屬［22］。根據(jù)極性基團(tuán)的解離性質(zhì)，表面活性劑可分為陰離子、陽(yáng)離子、非離子和兩性表面活性劑［22］。本次實(shí)驗(yàn)中，選擇了具有代表性的不同類型的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(w/w)的表面活性劑來(lái)研究它們與NADESs的協(xié)同作用。

表面活性劑對(duì)壇紫菜中重金屬的去除效果如圖6所示，不同類型的表面活性劑對(duì)重金屬具有不同的去除效率，其中，SDS的重金屬去除效果最好，對(duì)Pb、Cd、Cr、As和Cu的去除率分別為36.35%、90.01%、74.1%、91.28%和78.5%，但是參考GB2760－2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，SDS不能作為合法添加劑添加到食品中，所以它僅可用于非食品類樣品的重金屬去除研究，AG的去除效果僅次于SDS，是一種可以用于食品中的天然表面活性劑，其對(duì)Pb、Cd、Cr、As和Cu的去除率分別為35.13%、40.41%、32.3%、54.47%和28.12%，因此選擇AG與NADESs協(xié)同以提高NADESs的去除效果。

圖6 不同表面活性劑對(duì)壇紫菜中重金屬去除的影響Fig.6 Effects of different surface active agents on removal of heavy metal from P.haitanensis

2.3.2 AG與NADESs協(xié)同去除紫菜中重金屬效果研究 本次協(xié)同研究中分別選取了不同基質(zhì)中代表性的6種NADESs與AG進(jìn)行協(xié)同去除，分別是ChXyl(1，氯化膽堿－糖類)、ChMal(10，氯化膽堿－有機(jī)酸類)、ChPri(14，氯化膽堿－醇類)、GlyAla(16，甘油－氨基酸類)、PriGly(22，1，2－丙二醇－氨基酸類)和EgGly(25，乙二醇－氨基酸類)，這6種NADESs制備時(shí)間短，成本低，且去除率相對(duì)降低，可以更加明顯地觀察到AG對(duì)NADESs去除重金屬效果的提升。如表4所示，不同種類的NADESs在與AG混合后，其對(duì)重金屬去除率的提高有所不同，氯化膽堿類(1，10和14)的NADESs的協(xié)同效果整體好于多元醇類(16，22和25)，其中ChXyl與AG協(xié)同后五種重金屬的去除率均明顯增加，對(duì)Pb、Cd、Cr、As和Cu的去除率分別提高8.90%、5.89%、38.56%、10.52%和18.56%，故選擇ChXyl與AG進(jìn)行進(jìn)一步條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 AG溶液添加量對(duì)協(xié)同去除紫菜中重金屬的影響 圖7顯示了AG溶液添加量為0、10%、20%、30%、40%和50%時(shí)ChXyl的黏度變化，當(dāng)AG溶液添加量為10%時(shí)，ChXyl和AG混合體系的黏度顯著下降至初始黏度的1/7，并且隨著AG添加量的增加而不斷下降。圖8顯示了不同AG溶液添加量對(duì)ChXyl弛豫時(shí)間的影響，由圖8可知添加超過(guò)20%的AG溶液后，ChXyl弛豫時(shí)間明顯增加，表明ChXyl和AG混合體系中的相互作用急劇減弱，過(guò)量的AG溶液會(huì)影響ChXyl化學(xué)鍵的形成，從而影響重金屬去除效果。圖9顯示了AG溶液添加量對(duì)壇紫菜中重金屬去除率的影響，隨著AG溶液添加量的增加至20%，五種重金屬的去除率不斷提高并達(dá)到最大值，相較于協(xié)同前分別提高37.98%、11.22%、126.8%、30.54%和89.04%，ChXyl和AG溶液表現(xiàn)出較好的協(xié)同效果，AG溶液的最佳添加量為20%。

影響重金屬去除的因素有很多，包括吸附、傳質(zhì)、溶解和界面張力等［21］。添加表面活性劑將導(dǎo)致NADESs稀釋并引入更多的H2O分子，這不僅可以降低洗脫液的黏度，而且還可以作為介質(zhì)從壇紫菜表面上浸出已經(jīng)松散的金屬離子［18］。在2.2.1的研究中，含水量對(duì)去除重金屬的影響主要集中在0～10%的范圍內(nèi)，繼續(xù)添加表面活性劑至20%會(huì)導(dǎo)致壇紫菜中的重金屬離子膠束增溶［18］，因此ChXyl和AG混合體系的去除率將進(jìn)一步提高。

2.4 NADESs對(duì)壇紫菜品質(zhì)的影響

本研究中選取了氯化膽堿類NADESs中去除效果較好的ChCit(9)和多元醇類NADESs中去除效果較好的PriHis(23)在最優(yōu)條件下進(jìn)行去除，同時(shí)選取了ChXyl(1)與AG溶液協(xié)同去除，研究該混合體系對(duì)壇紫菜品質(zhì)的影響。

表4 不同NADESs協(xié)同AG對(duì)不同重金屬去除率的影響Table 4 Effect of NADESs and AG on the removal rate of different heavy metals

圖7 不同AG溶液添加量的ChXyl的黏度Fig.7 The viscosity of ChXyl diluted with different AG solution contents

圖8 不同AG溶液添加量的ChXyl的弛豫時(shí)間Fig.8 Relaxation time for different AG solution contents of ChXyl

圖9 AG溶液添加量對(duì)壇紫菜中重金屬去除率的影響Fig.9 Effects of AG solution content in ChXyl on removal of heavy metal from P.haitanensis

2.4.1 NADESs對(duì)壇紫菜中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響如表5所示，分別測(cè)定了壇紫菜脫除重金屬前后多糖、可溶性蛋白和脂肪的變化，其中純水為對(duì)照組，可以看出，ChXyl+AG和PriHis兩種洗脫劑處理后的多糖含量與未處理組相比無(wú)顯著差異，且均高于對(duì)照組，表明ChXyl+AG和PriHis對(duì)壇紫菜中多糖沒(méi)有明顯影響，且優(yōu)于水處理，ChCit處理后多糖含量顯著降低(P＜0.01)，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異;對(duì)于可溶性蛋白，包括對(duì)照組在內(nèi)的四種洗脫劑處理后其含量均顯著降低(P＜0.01)，其中PriHis對(duì)可溶性蛋白的影響相對(duì)較小;對(duì)比壇紫菜脫除重金屬前后脂肪含量的變化可以看出，四種洗脫劑處理后脂肪含量均降低，但降幅不大，其中ChXyl+AG和PriHis與對(duì)照組水處理后的脂肪含量沒(méi)有顯著差異。

脫除重金屬過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的降低主要是由于紫菜中重金屬的結(jié)合位點(diǎn)多為蛋白質(zhì)與多糖，在處理過(guò)程中隨著洗脫劑對(duì)重金屬的脫除，結(jié)合的蛋白質(zhì)與多糖也同時(shí)被去除［23］，其次是在處理過(guò)程中結(jié)合超聲輔助，導(dǎo)致紫菜部分細(xì)胞壁破裂，營(yíng)養(yǎng)成分溶出。然而NADESs對(duì)紫菜主要營(yíng)養(yǎng)成分的破壞與其基質(zhì)組成有較大關(guān)系?？傮w來(lái)看，ChCit對(duì)三種主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響最大，其主要成分是氯化膽堿和檸檬酸，p H較低，可以提供更多的H+與多糖和蛋白質(zhì)中與重金屬結(jié)合的官能團(tuán)進(jìn)行絡(luò)合和離子交換，同時(shí)酸性環(huán)境下輔助超聲處理更易導(dǎo)致紫菜細(xì)胞壁的破裂［21］，PriHis對(duì)三種主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響最小，且效果優(yōu)于對(duì)照組。

2.4.2 NADESs對(duì)壇紫菜感官品質(zhì)的影響 色澤和氣味是壇紫菜重要的品質(zhì)指標(biāo)，影響其商業(yè)價(jià)值，優(yōu)質(zhì)壇紫菜呈黑褐色，光澤明亮，具有紫菜特有的鮮香氣味，質(zhì)地均勻，結(jié)構(gòu)完整［24－25］。本研究對(duì)重金屬脫除前后壇紫菜的L*、a*、b*值進(jìn)行測(cè)定，探討了NADESs脫除重金屬對(duì)壇紫菜色澤的影響，同時(shí)對(duì)壇紫菜的色澤、氣味和形態(tài)進(jìn)行了感官評(píng)定。

由表6可以看出，經(jīng)過(guò)4種洗脫劑處理后的壇紫菜L*值均與處理前相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明對(duì)壇紫菜的亮度沒(méi)有影響，a*值在處理后均顯著降低(P＜0.01)，但均為正值，表明處理后紅度降低，b*值在處理后無(wú)顯著變化，但是脫除后的色澤仍可達(dá)到紫菜色澤要求，不影響紫菜質(zhì)量，表7為不同洗脫液處理后壇紫菜的感官評(píng)定，評(píng)定結(jié)果表明，ChXyl+AG、ChCit和對(duì)照組處理后壇紫菜依然保持明亮的深黑褐色，無(wú)異味，且質(zhì)地均勻結(jié)構(gòu)完整，即不會(huì)對(duì)壇紫菜的感官品質(zhì)造成影響，PriHis處理會(huì)對(duì)壇紫菜造成輕微褪色，但不會(huì)影響其氣味和形態(tài)。

2.4.3 NADESs對(duì)壇紫菜質(zhì)構(gòu)的影響 質(zhì)構(gòu)是評(píng)價(jià)壇紫菜質(zhì)量的重要因素，其主要指標(biāo)會(huì)影響紫菜的口感［26］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同處理方式去除重金屬后壇紫菜的硬度、剪切力、彈性和咀嚼性四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，硬度是第一次壓縮樣品的最大峰值，剪切力反映了樣品的嫩度，彈性是第二次壓縮中樣品恢復(fù)高度和第一次的壓縮變形量之比。根據(jù)圖10所示，ChCit處理后四種指標(biāo)均降低，ChCit是酸性溶液，在絡(luò)合重金屬的同時(shí)易導(dǎo)致紫菜細(xì)胞壁的破裂，從而影響其硬度、嫩度、彈性和咀嚼性，ChXyl+AG和PriHis處理對(duì)壇紫菜的硬度、嫩度和咀嚼性沒(méi)有影響，彈性降低，但均優(yōu)于對(duì)照組，主要原因是在去除過(guò)程中多糖溶出。

表5 不同洗脫劑對(duì)壇紫菜營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 5 Effects of different eluents on nutritional content of P.haitanensis

表6 不同洗脫劑對(duì)壇紫菜色澤的影響Table 6 Effects of different eluents on the color of P.haitanensis

表7 不同洗脫液處理后壇紫菜的感官評(píng)定Table 7 Sensory evaluation of P.haitanensis after treatment with different eluents

圖10 不同洗脫劑對(duì)壇紫菜質(zhì)構(gòu)的影響Fig.10 Effects of different eluents on the texture of P.haitanensis

3 結(jié)論

天然低共熔溶劑(NADESs)是一種新型綠色溶劑，具有很好的加工性能和環(huán)境經(jīng)濟(jì)效益，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，本研究制備了28種NADESs對(duì)壇紫菜中重金屬的去除效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明Pb、Cd、Cr、As和Cu的最高去除率分別 可達(dá)到87.54%、100.00%、48.59%、78.24%和79.73%，經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到最佳去除條件為:NADESs含水量為10%，固液比1∶20，60℃洗脫1 h，期間每15 min超聲2 min，在此條件下重金屬去除率分別提高了28.01%、25.60%、34.95%、35.48%和56.35%。表面活性劑也可用于重金屬的去除，實(shí)驗(yàn)表明，NADESs協(xié)同AG可以提高其原本的重金屬去除率，20%的表面活性劑含量為最佳的協(xié)同條件。

本研究選取了三種不同基質(zhì)的NADESs研究其去除重金屬前后對(duì)壇紫菜品質(zhì)的影響，分別是ChXyl+AG、ChCit和PriHis，結(jié)果表明，與對(duì)照組水相比，三種洗脫劑處理后可溶性蛋白含量均顯著降低(P＜0.01)，而ChXyl和PriHis對(duì)壇紫菜中脂肪和多糖無(wú)影響;結(jié)合色差和感官評(píng)定分析，只有PriHis對(duì)壇紫菜的色澤產(chǎn)生一定影響，其他處理均不影響壇紫菜的感官品質(zhì);ChCit處理后四種質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均降低，ChXyl+AG和PriHis處理對(duì)壇紫菜的硬度、嫩度和咀嚼性沒(méi)有影響，彈性降低，但均優(yōu)于對(duì)照組。本研究首次建立了一種環(huán)保、高效的NADESs去除壇紫菜中重金屬的方法，為綠色防治藻類食品中的重金屬污染問(wèn)題提供了理論依據(jù)和方法支持，也豐富了NADESs在食品工業(yè)中的應(yīng)用。