王美洪，陳善敏，許 洋，蔣和體，*

(1.西南大學食品科學學院，重慶400715;2.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶400715)

山藥(Rhizoma dioscoreae)，薯蕷科草本植物，含有皂苷、膽堿、糖蛋白和多種氨基酸，還有抗性淀粉、黃酮、尿囊素等活性保健成分［1－2］，有抗氧化、抗癌活性和調節(jié)脂質代謝等藥理作用［3］。由于山藥資源豐富，淀粉含量高，而且不具備分解纖維素和水解蛋白質的酶系統(tǒng)［4］，其作為一種優(yōu)良的保健醋發(fā)酵原料，既可滿足廣大消費者需求，也拓寬山藥銷售市場，減少其在運輸過程的腐爛敗壞，提高山藥的綜合利用率。

原料山藥在釀造過程糖化不完全的殘留物以及殺菌過程不徹底的粘稠產物，在裝瓶后會變性或聚集，從而使果醋在自然條件下難以澄清、易二次反濁、失光［5－6］，山藥醋的澄清勢在必行，以山藥為原料進行破碎、打漿、調整成分、發(fā)酵，通過添加不同的澄清劑對山藥醋進行澄清處理，山藥醋中的大分子物質被吸附，進而達到果醋澄清的目的。

陳珍金等［7］利用明膠對液態(tài)發(fā)酵柿子醋進行澄清，發(fā)現明膠添加量為3%－5%時，柿子醋澄清和除澀效果較好。盧維奇等［8］用幾丁質－麥飯石復合物澄清保健醋，發(fā)現兩澄清劑間存在協(xié)同作用使醋獲得良好澄清效果，且澄清后醋主要理化營養(yǎng)指標并無改變。目前對山藥這種兼具藥食同源的淀粉物質制作的保健醋產品極少，且對造成其商品價值下降的澄清技術的研究幾乎沒有。本試驗在單一澄清劑基礎上，利用響應面模型優(yōu)化最佳澄清條件，以透光率為參考指標，考察硅藻土和殼聚糖復合澄清的最適條件組合對山藥醋的澄清效果，以期為山藥醋澄清工藝提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試山藥 產自河南省商丘市，購于重慶市北碚區(qū)天生麗街永輝超市，選用同批次大小均一、無機械損傷和病害的新鮮山藥;酵母1383 實驗室4℃保藏;巴氏醋桿菌巴氏亞種1.41(Acetobacter pasteurianus subsp.Pasteurianus 1.41) 購于中國微生物菌種保藏管理中心;殼聚糖 廣東鹿鳴食業(yè)有限公司;硅藻土 河南順鑫食化生物科技;明膠 河南萬邦實業(yè)有限公司(以上均為分析純);果膠酶(2000 U/g)諾維信生物技術有限公司。

UNICO－7200分光光度計 上海巴玖實業(yè)有限公司;HWS－26電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器廠;PHS－3C酸度計 上海雷磁儀器廠;PAL－1手持糖度儀 上海上天精密儀器有限公司;HDL－4臺式離心機 常州市鴻科儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥醋的發(fā)酵工藝流程和操作要點

1.2.1.1 工藝流程 參考文獻［9］。

1.2.1.1 操作要點 打漿酶解:將蒸熟后的山藥去皮后按料液比1∶4(g∶mL)混合打漿后，等比加入0.15%葡萄糖淀粉酶(酶活50000 IU/g)和α－淀粉酶(酶活100000 IU/g)水浴鍋65℃糖化2 h后糖度為22%。

酒精發(fā)酵:糖化后的山藥漿在450W下微波滅酶2.5 min后調糖度到25%，高壓蒸汽滅菌后加入已活化的酵母菌擴培液，經28℃發(fā)酵24 h后換發(fā)酵栓，再25℃發(fā)酵6 d，發(fā)酵后測得酒精度13%，殘?zhí)橇?.35 g/100 mL。

醋酸發(fā)酵:山藥酒經過濾后，調節(jié)酒精度為7%，在121℃、15 min條件下對原酒進行高壓蒸汽滅菌后，加入15%活化后的巴氏醋酸桿菌擴培液，在30℃、120 r/min搖床條件下發(fā)酵，每隔12 h取樣測定酸值，至總酸值增長緩慢停止醋酸發(fā)酵。

澄清［10－12］:以澄清劑復配比例、添加量、澄清時間和澄清溫度四個因素對山藥醋的澄清工藝進行優(yōu)化，得到品質優(yōu)良的山藥醋。

1.2.2 山藥醋澄清條件優(yōu)化

1.2.2.1 單一澄清劑澄清 分別采用配制成10%的硅藻土、果膠酶、殼聚糖、明膠澄清劑溶液以1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，于40℃恒溫水浴鍋中靜置60 min，經3000 r/min離心12 min后，取上清液在480 nm處［13］測定透光率，同時做三組平行。

1.2.2.2 復合澄清劑澄清條件優(yōu)化單因素實驗 以單因素結果篩選出兩種效果最好的澄清劑做復合試驗，分別考察復合澄清劑配比、復合澄清劑總添加量、澄清溫度和澄清時間對山藥醋澄清效果的影響。

硅藻土與殼聚糖復合澄清劑按混合比5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3(g∶g)，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，在40℃下保溫60 min，3000 r/min離心12 min后，取上清液在480 nm處測定其透光率，確定復合澄清劑最佳配比。

以復合澄清劑配比1∶1，復合澄清劑總添加量按照1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，在40℃下保溫60 min，經離心后，取上清液測定其透光率，確定最適復合澄清劑總添加量。

以復合澄清劑配比1∶1，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中混合均勻，分別在25、30、35、40、45、50℃靜置60 min，離心后取上清液在480 nm處測定其透光率，確定最佳澄清溫度。

以復合澄清劑配比1∶1，總添加量3 g/L加入到20 mL山藥醋中，混合均勻，在40℃下分別對山藥醋保溫20、40、60、80、100、120 min。離心后取上清液測定其透光率，確定最佳澄清時間。

表1 中心組合試驗設計因素與水平Table 1 Range and corresponding levels of independent variables

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 根據單因素實驗結果，以澄清溫度(A)、復合澄清劑配比(B)、澄清時間(C)和復合澄清劑添加量(D)為自變量，山藥醋透光率為響應值(Y)，進行Box－Behnken中心組合試驗。響應面試驗因素見表1。

1.2.4 理化指標檢測 透光率:可見分光光度法;可溶性固形物:采用手持式糖度計測定;殘?zhí)?參照GB/T 5009.7－2008《食品中還原糖的測定》;總酸:參照GB/T 12456－2008《食品中總酸的測定》;氨基酸態(tài)氮:參照GB/T 12143－2008《飲料通用分析方法》。

1.3 數據處理

本實驗數據均為3次重復試驗的平均值±標準差，運用Excel 2016、GraphPad prism 8和Designexpert 8.06軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同澄清劑對山藥醋澄清效果影響 據透光率指標分析，四種澄清劑均對山藥醋澄清有效果，隨澄清劑濃度增加，透光率逐漸增大，當硅藻土、殼聚糖和明膠添加量分別為4、5、4 g/L時，透光率分別為80.1%、78.3%和77.6%，對醋體澄清效果較好;當果膠酶添加量為2 g/L時，山藥醋透光率達到最大值75.4%，較前三種澄清劑效果略差，而過多的澄清劑則會懸浮于醋體中讓透光率不增反減［14－15］。雖然殼聚糖和明膠對提高山藥醋澄清度并無顯著差別，但實驗發(fā)現，經明膠澄清后的山藥醋略帶異味，這與饒炎炎等［16］發(fā)現明膠添加過多會使果汁變色變味一致。最終選擇硅藻土和殼聚糖作為復合澄清劑。

圖1 不同澄清劑對山藥醋澄清效果影響Fig.1 Effects of different clarifiers on clarification effect of yam vinegar

2.1.2 復合澄清劑對山藥醋澄清效果影響的單因素實驗結果 不同復合澄清劑配比對澄清效果有較大影響。當澄清劑配比為2∶1時，山藥醋透光率為91.1%，說明適合的澄清劑配比對澄清效果有增效作用;隨著配比的增大，澄清劑間不同電荷渾濁物的互補效果被破壞［17］，透光率也隨之下降，因此選擇澄清劑配比為2∶1。

隨復合澄清劑添加量的增加，醋體中的小分子物質絮凝，透光率也相應增大，當復合澄清劑添加量為4 g/L時，透光率達到90.6%，此后澄清劑吸附能力到飽和，膠體物質被充分沉淀［20－22］，過量澄清劑懸浮于醋體而導致渾濁，因此選擇復合澄清劑添加量為4 g/L。

山藥醋透光度隨溫度逐漸增大，當澄清溫度為35℃時，透光率達最大值91.6%，說明適宜溫度既促進硅藻土多孔結構對醋體中色素、酵母等懸浮物的吸附作用，也增強了硅藻土和殼聚糖之間的相互作用，形成穩(wěn)定的熱力學體系［18－19］，而過高溫度則會影響醋中沉降顆粒物質的穩(wěn)定性，從而使醋體渾濁，根據試驗結果選擇澄清溫度為35℃。

圖2 單因素變量對山藥醋澄清效果的影響Fig.2 Effects of single factor variable on clarification effect of yam vinegar

表2 山藥醋響應面試驗結果Table 2 Response surface test results of yam vinegar

表3 回歸模型顯著性結果Table 3 Significance test for regression model

澄清時間在20～60 min時，透率光從80.5%增至87.8%，增幅明顯，此時澄清劑與山藥醋中與相應物質發(fā)生靜電、沉降、分解等作用［23］，加速了醋中色素的吸附和酵母、蛋白質等懸浮顆粒的沉淀，此后透光率穩(wěn)定在90.2%左右，說明醋體中渾濁物質基本被凝聚沉降，醋體得以澄清。結合實際生產中生產成本及能耗等因素，最終選擇澄清時間為80 min左右。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面優(yōu)化復合澄清條件 為確定澄清工藝的最佳條件，本試驗在單因素實驗基礎上，利用響應面法優(yōu)化復合澄清劑對山藥醋的澄清效果，研究自變量及其交互作用對山藥醋澄清效果的影響，確定最佳澄清工藝參數。

用Design Expert 8.06軟件對表2的試驗數據進行回歸擬合［24－25］，獲得山藥醋透光率的數學模型的二次多項回歸方程:

Y=95.56+1.29A+0.88B+1.71C－1.13D－0.20AB+0.15AC－0.85BC+0.45BD+0.53CD－1.32A2－1635B2－2.04C2－1.63D2

為了檢驗方程的有效性，對山藥醋透光率的模擬方程進行方差分析，結果見表3。

圖3 各因素交互作用對透光率影響的響應面Fig.3 Response surface of interaction of various factors on transmittance

由表3可知，模型極顯著，失擬項不顯著，模型決定系數R2=0.9859，說明回歸方程有較高擬合度和相關性，模型預測值能較好地反映實際值［26］，可以對復合澄清劑優(yōu)化澄清山藥醋的條件進行分析和預測。模擬項的A、B、C、D、AD、BC、A2、B2、C2、D2達到極顯著水平(P＜0.01)，BD、CD達到顯著水平(P＜0.05)。AB、AC對響應值均無顯著影響。各因素透光率的影響順序分別是:澄清時間＞澄清溫度＞澄清劑添加量＞復合澄清劑配比(硅藻土∶殼聚糖)。

2.2.2 因素交互作用分析 交互作用分析中等高線圖能夠直接反映各因素對響應值的影響及各因素間相互作用的強弱，各因素交互作用對透光率的影響見圖3。

由圖3可得，響應面均向下開口且曲面較陡，透光率隨各因素的增大呈現先增加后減小的趨勢，澄清溫度和澄清時間、澄清溫度和復合澄清劑配比的交互作用響應面圖等高線呈圓形，說明其交互作用不顯著;而澄清時間和澄清劑添加量、復合澄清劑配比和添加劑添加量、復合澄清劑配比和澄清時間、澄清溫度和澄清劑添加量的響應面圖等高線呈橢圓形，說明其交互作用對透光率的影響較顯著，這與表3中結果相符合。

2.2.3 山藥醋最佳澄清效果的條件驗證試驗 采用Design－Expert 8.06軟件對數據進行響應面分析，得出最佳澄清條件:溫度36.38℃，復合澄清劑配比硅藻土∶殼聚糖為2.33∶1時，澄清時間83.01 min，復合澄清劑添加量3.75 g/L，此條件下山藥醋透光率預測值96.11%，考慮實踐操作簡便性并檢驗其合理性，取硅藻土與殼聚糖配比5∶2(g∶g)、復合澄清劑添加量}澄清溫度36.5℃、澄清時間83 min下進行驗證試驗，重復三次取均值，得到山藥醋透光率為95.8%，基本接近預測值。證明該模型優(yōu)化復合澄清劑澄清山藥醋的條件的可行性和有效性。

2.3 山藥醋澄清效果及品質評價

選擇硅藻土和殼聚糖這兩種澄清劑，分別在最佳條件下對山藥醋進行單一和復合處理，測定其基本理化指標。由表4可知，單一澄清劑中硅藻土對山藥醋的澄清效果最好，透光率高達80.1%，同時能較好地保持山藥醋中可溶性固形物、總酸和氨基酸態(tài)氮的含量，殼聚糖的澄清效果僅次于硅藻土，透光率達到78.3%，但其對氨基酸態(tài)氮的保存率低于硅藻土，可能原因是殼聚糖和蛋白質之間存在氫鍵形式的靜電引力，其相互作用會加速蛋白質和游離氨基酸的吸附［27］。復合澄清劑的澄清效果明顯優(yōu)于其他單一澄清劑，透光率達到95.8%，澄清后醋體澄淺黃棕，清透有光澤，帶有濃郁醋香，口感酸而不澀無雜物，同時能夠較好地保存山藥醋的品質，因此，復合澄清是山藥醋的最佳澄清方法。

表4 山藥醋的理化指標Table 4 Physical and chemical indexes of yam vinegar

3 結論

山藥醋中含有蛋白質、酵母、色素、單寧等大分子物質，這些物質會造成醋體渾濁、不穩(wěn)定［28－30］。通過不同的澄清劑處理山藥醋，比較其透光率以及各項指標，可知復合澄清劑處理山藥醋的澄清效果明顯優(yōu)于單一澄清劑，最佳澄清條件為:硅藻土與殼聚糖配比5∶2，澄清溫度為36.5℃，澄清時間為83 min，復合澄清劑添加量4 g/L。在此條件下，經驗證性試驗得出山藥醋澄清的透光率為最大值，達到95.8%，比原醋升高了27%，同時對山藥醋其他各項指標均無明顯影響，氨基酸態(tài)氮0.27 g/100 mL，總酸5.29 g/100 mL，可溶性固形物8.74°Bx，處理后的山藥醋呈淺黃棕，色澤均勻透亮，醋味酸感柔和。