蘇本正，都波，周建永

（1.山東省中醫(yī)藥研究院，濟南 250014； 2.天俱時工程科技集團有限公司山東分公司，濟南 250101）

高效液相色譜以其靈敏、快捷、可分離大多數(shù)液體樣品等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于中藥有效成分含量測定、組分分析、指紋圖譜等方面［1］。紫外檢測器（UV）具有高靈敏度和穩(wěn)定性，因此高效液相色譜中應(yīng)用較為廣泛，但是對于沒有紫外吸收或紫外末端吸收的有機化合物，其無法檢測。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）彌補了上述紫外檢測器的不足，顯示出極大的優(yōu)越性［2–4］。2020年版《中國藥典》已經(jīng)在黃芪、四季青、酸棗仁、山銀花等20種中藥材的含量測定項目中使用蒸發(fā)光散射檢測器［5］。

北沙參是傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.）的干燥根，為常用中藥，可緩解口燥咽干、肺熱咳嗽等病癥［6–8］，其主要化學(xué)成分為糖類、香豆素類、磷脂、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油、微量元素等［9–11］。有研究表明，北沙參中的糖類成分含量最高［12］，具有較好的抗腫瘤、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)活性［13–15］。因此對北沙參中糖類成分進行測定，可以有效評價北沙參的質(zhì)量，保證臨床用藥有效性。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，可從整體上鑒別評價中藥材及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性、穩(wěn)定性［16–17］。成分測定與指紋圖譜聯(lián)合使用，可以全面評價中藥的質(zhì)量。

目前法定標(biāo)準(zhǔn)中沒有北沙參的含量測定和指紋圖譜檢測項目，為了增強標(biāo)準(zhǔn)的可控性，筆者建立了北沙參的指紋圖譜測定方法和蔗糖的含量測定方法，以期為制訂北沙參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695型，附帶Waters 2420型蒸發(fā)光散射檢測器和Empower 色譜工作站，美國waters公司。

精密電子天平：AGBP210S型，感量為0.000 01 mg，德國Sartorius公司。

乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾公司。

實驗所用其余試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

蔗糖對照品：50 mg，編號為1507–200001，中國藥品生物制品檢定研究院。

北沙參藥材編號和來源見表1。

表1 北沙參藥材樣品來源表

1.2 對照品溶液的制備

取蔗糖對照品10 mg，精密稱定，加水定容至10 mL的量瓶中，配制成1 mg／mL的蔗糖對照品溶液，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3 樣品溶液的制備

取北沙參樣品粉末（過0.42 mm篩）4 g，精密稱定，加40%乙醇240 mL，超聲提?。üβ?50 W，頻率53 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液100 mL，濃縮至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Innoval NH2色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京艾杰爾科技有限公司）；流動相：乙腈–水（80∶20），等度洗脫；流量：1 mL／min；柱溫：30℃；ELSD的漂移管溫度：60℃；噴霧器加熱級別：100%；氣體壓力：137.90 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒸發(fā)光散射檢測器系統(tǒng)條件的優(yōu)選

2.1.1 正交試驗因素、水平設(shè)計

蒸發(fā)光散射檢測器的系統(tǒng)條件由噴霧器加熱級別、漂移管溫度、氣體壓力和增益4個條件組成，由于增益值僅影響信號放大的程度，對檢測結(jié)果沒有影響，所以本試驗以漂移管溫度A、噴霧器加熱級別B、氣體壓力C為3個考察因素，每個因素分別設(shè)有三個水平，通過正交試驗對檢測器條件進行優(yōu)選，因素水平見表2。

表2 因素水平表

2.1.2 正交試驗方法與結(jié)果

精密吸取對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀進行檢測。以蔗糖的峰面積作為評價指標(biāo)，優(yōu)選條件。結(jié)果見表3～表5。

表3 正交試驗安排表

表4 正交試驗結(jié)果表

表5 方差分析表

由表5可知，A、C兩個因素P值均小于0.05，說明漂移管溫度、氣體壓力這兩個因素對蔗糖的測定均具有顯著性意義；B因素的P值大于0.05，說明噴霧器加熱級別對蔗糖的測定不具有顯著性意義。根據(jù)試驗結(jié)果進行直觀分析，A1B3C1為最佳選擇，即漂移管溫度為60℃，噴霧器加熱級別為100%，氣體壓力為137.90 kPa。

2.2 色譜條件選擇與色譜圖

氨基柱其固定相是以超純?nèi)嗫浊蛐喂枘z為基質(zhì)，通過采用獨有的固定相鍵合技術(shù)，使用含有氨基丙基官能團的有機硅烷鍵合而成，能比硅膠柱更快達到平衡，對流動相的水含量沒有硅膠柱敏感。氨基柱可用于極性化合物的正相分析，弱陰離子交換以及含水的反相液相分析。氨基柱柱被廣泛應(yīng)用于木糖、乳糖、葡萄糖等糖類的反相分析模式中。故本實驗選用氨基柱作為色譜柱。

分別吸取蔗糖對照品溶液和樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀檢測，開啟ELSD采集信號，得到蔗糖對照品和樣品的蒸發(fā)光檢測色譜圖，見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，對照品圖譜和樣品圖譜中，ELSD檢測到蔗糖峰在11.5 min附近。

圖1 蔗糖對照品的HPLC–ELSD圖

圖2 樣品溶液的HPLC–ELSD 圖

2.3 線性關(guān)系與檢出限

取蔗糖對照品溶液，分別進樣2.5、5、10、15、20、25 μL，經(jīng)ELSD檢測，以蔗糖進樣質(zhì)量的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)X，以蔗糖峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，進行線性回歸計算得線性回歸方程為Y=1.118 0X+11.86（r=0.999 7），結(jié)果表明，蔗糖進樣質(zhì)量在7.30～72.95 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將蔗糖對照品溶液逐級稀釋，分別進樣分析，以3倍信噪比計算檢出限，計算得檢出限為0.02 mg／mL。

表6 蔗糖經(jīng)ELSD檢測的線性關(guān)系數(shù)據(jù)

2.4 精密度試驗

取S2號樣品溶液，連續(xù)進樣6次，進行HPLC指紋圖譜分析。分別記錄各共有峰的保留時間和峰面積，并對其峰面積結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表7（其中4號峰為蔗糖色譜峰）。表7結(jié)果表明，各共有峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明該方法精密度良好。

表7 精密度試驗結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗

取S2號樣品溶液，在室溫下保存，分別于0、2、4、8、24 h測定，結(jié)果見表8。由表8可知，各共有峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明北沙參樣品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

表8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗

取S2號樣品，按照樣品溶液的制備方法，平行制備6份供試液，分別進樣，記錄HPLC色譜峰面積，計算北沙參樣品中的蔗糖含量，結(jié)果見表9。由表9可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表9 ELSD檢測器測定的重復(fù)性實驗結(jié)果

2.7 回收試驗

取已知蔗糖含量的北沙參粉末約2 g，精密稱定，平行6份，分別加入蔗糖對照品約60 mg，按照樣品溶液的制備方法制備供試液，進行HPLC測定，結(jié)果見表10。由表10可知，平均回收率為98.85%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表10 回收試驗結(jié)果

2.8 指紋圖譜的建立

將對照品溶液和各批北沙參樣品溶液分別進樣，記錄HPLC色譜數(shù)據(jù)。選擇了6個色譜峰為共有峰，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積值，結(jié)果見表11、表12。

表11 指紋圖譜的共有峰相對保留時間結(jié)果

表12 指紋圖譜的共有峰相對峰面積結(jié)果

2.9 指紋圖譜相似度分析

采用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004A），對10批北沙參藥材的指紋圖譜進行相似度分析。該軟件具有生成校對照圖譜的功能，相似度計算方法為夾角余弦法，可支持多點校正。首先將實驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，選定4號峰為參比峰，設(shè)定中位數(shù)的匹配模式，將色譜峰進行多點校正后自動匹配，即自動生成對照譜峰，相似度計算結(jié)果見表13。由表13可知，與對照指紋圖譜相比，10批北沙參藥材平均相似度為0.985，相似性結(jié)果良好；北沙參藥材之間的相似度值為0.917～1.000，說明各批藥材間存在差異。因此本實驗所建立的HPLC指紋圖譜可作為北沙參藥材質(zhì)量控制的有效手段之一。

表13 批北沙參藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果

3 結(jié)語

建立了HPLC-ELSD法測定北沙參蔗糖含量的方法，該法測定蔗糖保留時間穩(wěn)定，測定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、回收率符合檢測要求。與紫外檢測器比較，具有干擾少、基線無漂移、專屬性強等特點。建立了北沙參藥材的指紋圖譜，不同來源北沙參藥材之間雖存在一定差異，但整體相似度良好，可作為北沙參藥材的質(zhì)量控制的有效手段之一。2020版藥典中并沒有對北沙參的含量進行規(guī)定，僅通過性狀鑒別無法全面的評價藥材質(zhì)量，本研究可以為更好地評價北沙參的質(zhì)量提供參考。