安巧云，魏敏，周劍，柴艷兵，張耀廣，王夢(mèng)，曹玉蘭，李興佳

(1.君樂寶乳業(yè)集團(tuán)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

乳粉及乳制品在食品中的重要性日趨明顯，乳制品行業(yè)也一直是我國(guó)民生的重要產(chǎn)業(yè)［1］，其中，脂肪是膳食能量的重要來源，但攝入過多脂肪也會(huì)造成肥胖癥，故脂肪含量成為了乳粉的重要檢測(cè)項(xiàng)目［2–4］。穩(wěn)定性良好的脂肪標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)于保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性起著關(guān)鍵作用，在乳制品檢驗(yàn)中也發(fā)揮著重要意義。國(guó)內(nèi)外該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用范圍日益廣泛［5–6］。經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心網(wǎng)站查詢，目前乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)仍很欠缺。企業(yè)實(shí)驗(yàn)室需要大量購(gòu)置進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，既增加了成本，又使標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)行業(yè)受制于人，不利于行業(yè)的發(fā)展。因此開發(fā)乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有著重要的意義。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常是包含被分析物的真實(shí)樣品，它們以自然形式存在于自然環(huán)境中，應(yīng)選擇與測(cè)試樣品基體相似的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并準(zhǔn)確定值。Gandra等［7］研制了全脂乳粉中水分、灰分、脂肪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；楊軼眉［8］采用充氮密封的方式研制了嬰幼兒配方奶粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。筆者采用真空密封及輻照處理，進(jìn)一步改善了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。定值方法的建立基于GB 5009.6—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》第三法［9］，原理是用無(wú)水乙醚和石油醚抽提樣品的堿（氨水）水解液，通過蒸餾或蒸發(fā)去除溶劑，測(cè)定溶于溶劑中的抽提物的質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值采用6家乳制品檢測(cè)相關(guān)或行業(yè)權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及不確定度評(píng)估［10–11］，確保在使用過程中量值準(zhǔn)確可靠［12–13］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電熱恒溫水浴鍋：HWS–26型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

鼓風(fēng)干燥箱：XT5118M–OV240型，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

三維混勻機(jī)：KSH-50型，北京錕捷玉城機(jī)械設(shè)備有限公司。

電子天平：ME204E，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒公司。

乙醇、無(wú)水乙醚、石油醚、剛果紅、鹽酸：分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司。

乳粉：君樂寶乳業(yè)有限公司。

氨水：分析純，石家莊市試劑廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法

稱取1.0 g乳粉樣品置于抽脂瓶中，加入10 mL 60 ℃的水，充分混合。加入2.0 mL氨水，充分混合后立即將抽脂瓶放入60 ℃的水浴中，加熱20 min，不時(shí)取出振蕩，靜置30 s。取出，冷卻至室溫。加入10 mL乙醇，緩慢地混合均勻（采用手搖式混勻，蓋上抽脂瓶塞，緩慢傾斜抽脂瓶，使抽脂瓶小球中的液體完全傾出，再使抽脂瓶恢復(fù)到垂直狀態(tài)，為一次混勻，反復(fù)此操作5次以上可達(dá)到徹底混勻的目的）。加入25 mL乙醚，輕輕振蕩搖勻。加入25 mL石油醚，輕輕振蕩搖勻。將抽脂瓶靜置至少30 min，直到上層液澄清，并明顯與水相分離。將上層液盡可能地倒入已準(zhǔn)備好的加入沸石的脂肪收集瓶中，避免倒出水層進(jìn)入抽脂瓶中。加入5 mL乙醇，用15 mL無(wú)水乙醚和15 mL石油醚，進(jìn)行第2次抽提。用15 mL無(wú)水乙醚和15 mL石油醚，進(jìn)行第3次抽提。合并所有提取液，于沸水浴上蒸發(fā)至干來除掉溶劑。將脂肪收集瓶放入(100±5)℃的烘箱中干燥1 h，取出后置于干燥器中冷卻0.5 h后稱量。重復(fù)以上操作至恒重(直至兩次稱量的差不超過2 mg)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物原料為與日常檢測(cè)水平相當(dāng)?shù)娜榉?，?jīng)過三維混勻機(jī)混勻，用避光鋁箔袋真空密封封裝，按5 g／袋包裝，共包裝800個(gè)單元，按輻照劑量為5.5 kGy，輻照時(shí)間為4 h進(jìn)行輻照，于–20 ℃冷凍保存。

1.4 均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.4.1 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)JJG 1006—1994 《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》和JJF 1343—2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》［14–15］的要求，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝中隨機(jī)抽取25個(gè)單元，做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，每個(gè)單元中最小取樣量為1.00 g，平行取3次，檢驗(yàn)方法與基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法相同。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)包括長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)和短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)按先密后疏的原則，分別在第0、1、2、4、6月進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法與定值方法相同，每次取二個(gè)獨(dú)立包裝，每個(gè)包裝取平行測(cè)定3次。

短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)根據(jù)模擬運(yùn)輸條件，將樣品置于4 ℃和50 ℃下，分別在第0、1、3、5、7天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)方法與定值方法相同。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值及數(shù)據(jù)處理

聯(lián)合6家實(shí)驗(yàn)室按1.2定值方法進(jìn)行定值。數(shù)據(jù)處理為用達(dá)戈斯提諾法考察所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性，用狄克遜檢驗(yàn)法考察離群值，用科克倫檢驗(yàn)法考察是否等精度。

2 結(jié)果與討論析

2.1 均勻性檢驗(yàn)

對(duì)隨機(jī)抽取的25個(gè)單元進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。用F檢驗(yàn)法對(duì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果做方差分析，通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷不同單元中乳粉中脂肪含量的測(cè)量值之間有無(wú)系統(tǒng)性差異。從表1數(shù)據(jù)計(jì)算得F=1.05，查表得F臨界值F0.05(24,50)=1.86，F(xiàn)＜F0.05(24,50)，表明組內(nèi)與組間無(wú)明顯差異，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，說明樣品是均勻的。

表1 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性檢驗(yàn)以時(shí)間x為縱坐標(biāo)、乳粉中脂肪測(cè)定值y為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)時(shí)間和結(jié)果擬合直線，采用趨勢(shì)分析法，對(duì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2，擬合直線為y=0.000 064x+26.476，其中斜率β1=0.000 064，截距β0=26.476。

表2 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)計(jì)算得s(β1)=0.000 106 6，自由度為n–2、置 信 水 平 為95%的t因 子t0.95，n–2=3.18。t0.95，3s(β1)=3.18×0.000 106 6=0.000 338 842 88。

因?yàn)閨β1|=0.000 064，|β1|＜t0.95，3s(β1)，因此說明乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在該包裝儲(chǔ)存條件下，6個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。

短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)同樣采取趨勢(shì)分析法對(duì)4 ℃和50 ℃的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。

表3 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

4 ℃儲(chǔ)存條件下得到的擬合直線為y=0.000 271x+26.305，其中斜率β1=0.000 271，截距β0=26.305。由表3數(shù)據(jù)計(jì)算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.000 311 460 29，|β1|＜t0.95，3s(β1)，說明4 ℃條件下乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)穩(wěn)定的。

50℃儲(chǔ)存條件下得到的擬合直線為y=–0.000 18x+26.368，其 中 斜 率β1=0.000 18，截 距β0=26.368。由表3數(shù)據(jù)計(jì)算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.001 204 116，|β1|＜t0.95，3s(β1)，說明50 ℃條件下乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果

乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6家實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果列于表4，6家實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的總平均值為26.5%。

表4 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果

2.3.1 正態(tài)檢驗(yàn)

對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)D檢驗(yàn)法(達(dá)戈斯提諾法)，得D值為0.273 1，大于臨界值0.271 7，因此該組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。

2.3.2 異常值檢驗(yàn)

根據(jù)GB／T 4883—2008 《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋–正態(tài)樣本離群值的判斷和處理》［16］，采用狄克遜準(zhǔn)則對(duì)各實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將定值結(jié)果按照由小到大的順序排序：X1=26.11，……Xn–2=26.85，Xn–1=26.87，Xn=26.88，n=54，由狄克遜檢驗(yàn)表查?(0.05，54)=0.32，r1和rn均小于?(0.05，54)，故全部數(shù)據(jù)均應(yīng)保留。

2.3.3 等精度檢驗(yàn)

6家實(shí)驗(yàn)室均采用堿水解法作為定值方法，采用科克倫法檢驗(yàn)平均值間是否等精度，先計(jì)算6組數(shù)據(jù)中每組9個(gè)數(shù)據(jù)的方差，再計(jì)算其中的最大方差與6組方差和之比。

根據(jù)科克倫檢驗(yàn)準(zhǔn)則，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量6組方差和為0.024，其中最大方差與6組方差和之比：

查表得C(0.05，6，9)=0.381 7，C＜C(0.05，6，9)，表明各平均值間為等精度。

因此，以6家實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的總平均值作為本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乳粉中脂肪定值結(jié)果w=26.5%。

2.4 不確定度評(píng)定

脂肪基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源由三個(gè)部分組成：（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值引入的不確定度；（2）測(cè)量方法引入的不確定度；（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度；（4）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度［17–19］。

2.4.1 定值引入的不確定度

由于本研究工作采用堿水解法，其它合作定值單位也采用了堿水解法獨(dú)立測(cè)量，經(jīng)柯克倫檢驗(yàn)和迪克遜檢驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)異常值，最終定值結(jié)果為6家實(shí)驗(yàn)室的合作定值結(jié)果，將這6組實(shí)驗(yàn)室的平均值w作為一組新的數(shù)據(jù)，則：

2.4.2 測(cè)量方法引入的不確定度

根據(jù)結(jié)果的計(jì)算過程，在定值過程中主要是稱量參與結(jié)果計(jì)算，B類不確定度主要由以下幾個(gè)部分引入：測(cè)量結(jié)果重復(fù)性；涉及稱量共5次，m、m1、m2、m3、m4分別為樣品質(zhì)量、恒重后脂肪收集瓶和脂肪的質(zhì)量、脂肪收集瓶的質(zhì)量、空白實(shí)驗(yàn)中恒重后脂肪收集瓶和抽提物的質(zhì)量、空白實(shí)驗(yàn)中脂肪收集瓶的質(zhì)量。需要考慮的質(zhì)量分量包括m、m1、m2、m3、m4，其中m是二次稱量，m2、m4都是一次稱量得到而只考慮天平的校準(zhǔn)，m1、m3不僅考慮天平的校準(zhǔn)還要考慮恒重的問題。

m2、m4引入的不確定度只需考慮天平的校準(zhǔn)，按照檢定證書給出天平校正產(chǎn)生的不確定度為0.5 mg（k=2），則um2=um4=0.5／2=0.25 (mg)，在 脂肪一次檢測(cè)過程中，m1=70.277 3 g，m2=70.012 2 g，m3=70.682 3 g，m4=70.682 2 g。

2.4.3 均勻性引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性以獨(dú)立測(cè)定平行實(shí)驗(yàn)來表示，即以瓶間和瓶?jī)?nèi)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)準(zhǔn)偏差SH表示。

由表1均勻性試驗(yàn)結(jié)果得出：瓶間方差Q1=0.004 172，瓶?jī)?nèi)方差Q2=0.008 247 9。

均勻性引入的相對(duì)不確定度：

ubb,rel=ubb／w=0.000 18／(26.5%)=0.065%

2.4.4 穩(wěn)定性引入的不確定度

脂肪乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算：

ults=st=s(β1)t=0.000 106 6×6=0.000 64

脂肪乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)不確定度：

ults,rel=0.000 64／(26.5%)=0.241%

短期穩(wěn)定性引入的不確定度根據(jù)表3按50℃的數(shù)據(jù)計(jì)算：

usts=st=s(β1)t=0.000 378 7×7=0.002 65

短期穩(wěn)定性引入的相對(duì)不確定度按50℃的數(shù)據(jù)計(jì)算：

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的合成不確定度：

擴(kuò)展不確定度：

UCRM=UCRM,relw=(2.160%)×(26.5%)=0.6%

2.5 定值結(jié)果

乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果：

3 結(jié)語(yǔ)

研制了乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值結(jié)果為26.5%，擴(kuò)展不確定度為0.6%。該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲批為國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于方法評(píng)價(jià)確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控樣品等，為我國(guó)乳品質(zhì)量安全檢測(cè)提供有力的保障手段。