李巧英 鄭戈文 任路路 張 華

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站 太原030006）

隨著我國(guó)玉米產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和育種技術(shù)的更新?lián)Q代，玉米品種數(shù)量逐年增多，品種之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，遺傳差異越來(lái)越小，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以區(qū)分眾多品種，使種子檢測(cè)工作受到一定限制。 近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展， 基因水平檢測(cè)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在種子檢測(cè)方面。 SSR 分子標(biāo)記方法試驗(yàn)重復(fù)性好、多態(tài)性高、周期短，可以快速準(zhǔn)確地區(qū)分品種。 楊雙[1]利用SSR 分子標(biāo)記鑒定玉米品種沈玉21；郭奕生等[2]利用 SSR 分子標(biāo)記鑒定玉米品種真實(shí)性。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，在一定電壓作用下，將不同大小的核苷酸片段分離開(kāi)，經(jīng)過(guò)染色、顯影、定影后，分析指紋圖譜； 熒光毛細(xì)管電泳是通過(guò)毛細(xì)管將長(zhǎng)短不一的核苷酸片段在高壓電場(chǎng)中分離，通過(guò)軟件分析數(shù)據(jù)，比較峰值圖差異，可以實(shí)現(xiàn)多樣品、多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，工作效率大大提高[3]。 2020 年，筆者用SSR 分子標(biāo)記方法區(qū)分10 個(gè)玉米雜交種， 從40 對(duì)SSR 引物中篩選出3 對(duì)多態(tài)性高的引物進(jìn)行擴(kuò)增， 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行分析。SSR分子標(biāo)記法區(qū)分玉米種子雜交種，可操作性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適用范圍廣，熒光毛細(xì)管電泳品種區(qū)分能力強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用10 份玉米雜交種及其標(biāo)準(zhǔn)樣品，品種編號(hào)及名稱(chēng)，1：先玉 508；2：先鋒 32D22；3：晉單73；4：寬誠(chéng) 60；5：先玉 335；6：忻黃單 78；7：農(nóng)華 101；8：晉單 55；9：農(nóng)夫 9 號(hào)；10：詠豐 1 號(hào)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取 樣品前處理，將玉米種子避光培養(yǎng) 3～4 d， 取植株幼葉 1～2 cm， 將 20～25 株樣品混合加液氮充分研磨提取DNA， 或種子磨粉后取50～100 mg 試樣，轉(zhuǎn)入 2.0 mL 離心管進(jìn)行提取。 DNA 提取可以用CTAB 法、SDS 法、 磁珠法或其他試劑盒方法，溶解后，用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，稀釋成工作液備用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 從 NY/T 1432－2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 標(biāo)記法》[4]的40 對(duì)引物中篩選出3對(duì)多態(tài)性好、差異明顯、峰型易識(shí)別的熒光標(biāo)記引物umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2 進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及等位基因見(jiàn)附表。 PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照NY/T 1432－2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 標(biāo)記法》[4]。

附表 SSR 引物序列及等位基因

1.2.3 電泳檢測(cè)

（1）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物變性，4.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分析指紋圖譜， 觀察待測(cè)樣品是否有標(biāo)準(zhǔn)樣品所具有的獨(dú)特標(biāo)記， 確定待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品在該位點(diǎn)指紋是否一致。

（2）熒光毛細(xì)管電泳分析，將擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)記熒光顏色及等位基因大小分組，用ABI 3500 基因分析儀分離PCR 產(chǎn)物，用SSR 指紋分析器分析不同品種在該位點(diǎn)的基因型， 檢測(cè)結(jié)果與SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)[5]，確定待測(cè)樣品的品種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

用3對(duì)SSR引物umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2擴(kuò)增10 個(gè)待測(cè)樣品，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖1 可知，10 個(gè)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋類(lèi)型均一致， 由此可知待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品在這3 個(gè)位點(diǎn)無(wú)差異，結(jié)合其他引物檢測(cè)結(jié)果，待測(cè)樣品為該標(biāo)注品種。 引物P24 共檢測(cè)到3 個(gè)等位基因、4 種基因型，將10 個(gè)待測(cè)樣品分成4 種類(lèi)型。 引物P27 共檢測(cè)到4 個(gè)等位基因、7 種基因型， 將在位點(diǎn) P24 表現(xiàn)為同一基因型的待測(cè)樣 1、2、4、10 分成3 種不同類(lèi)型。 引物P37 共檢測(cè)到4 個(gè)等位基因、5 種基因型，將P24 和P27 兩個(gè)位點(diǎn)譜帶一致的樣品1、2、5、7 分成不同類(lèi)型。 經(jīng) 3 對(duì)引物組合擴(kuò)增后，分析指紋圖譜，將10 個(gè)不同的玉米雜交種品種準(zhǔn)確地區(qū)分開(kāi)。 且由圖1 可知，這3 對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜主帶明顯，無(wú)非特異擴(kuò)增，分離效果好，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目的條帶的準(zhǔn)確判讀。 分析結(jié)果表明該引物組合多態(tài)性高、位點(diǎn)特異性強(qiáng)。

圖1 引物P24、P27、P37 擴(kuò)增10 個(gè)玉米品種變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)圖譜

2.2 熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)

熒光引物 umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2 擴(kuò)增10 個(gè)玉米種子雜交種， 毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，引物P24 擴(kuò)增10 份樣品后共檢測(cè)到4 個(gè)等位基因、6 種基因型， 疊加峰圖上表現(xiàn)為4 個(gè)主峰，等位基因 222 bp 頻率較高。 引物 P27 共檢測(cè)到5 個(gè)等位基因、8 種基因型，等位基因271 bp 頻率較高。 引物P37 共檢測(cè)到6 個(gè)等位基因、8 種基因型，等位基因197 bp 頻率較高。 檢測(cè)結(jié)果與SSR 標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中同名樣品指紋比對(duì)[6]，并將10 個(gè)玉米種子品種區(qū)分出。 分析圖2 中3 對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的疊加峰圖，主峰明顯、無(wú)雜峰、峰型整齊，數(shù)據(jù)讀取精確，避免了人為讀數(shù)誤差。 并且3 對(duì)引物等位變異范圍 P24（212～241，無(wú) 214bp）、P27（265 ～332）、P37（177-214，無(wú)212 bp）沒(méi)有重合，可以組合進(jìn)行多重電泳分析，提高了工作效率，降低了試劑成本。

兩種不同電泳檢測(cè)平臺(tái)數(shù)據(jù)結(jié)果會(huì)有一定偏差， 但都可以實(shí)現(xiàn)區(qū)分不同品種， 我們采用設(shè)置Marker 和參照樣品、延長(zhǎng)聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)間、減小人員分析誤差等方法來(lái)減少不同電泳檢測(cè)平臺(tái)間的偏差，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)整合。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記方法區(qū)分玉米種子雜交種，引物選擇和電泳方法是關(guān)鍵，要選擇區(qū)分能力強(qiáng)、多態(tài)性高的特異性標(biāo)記， 優(yōu)質(zhì)的引物組合可以極大提高品種區(qū)分效率，降低檢測(cè)成本。

圖2 3 對(duì)引物擴(kuò)增10 個(gè)玉米品種熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)疊加峰

本研究中， 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳，均可將10 個(gè)不同玉米品種區(qū)分開(kāi)。 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是通過(guò)兩兩樣品比較分析，檢測(cè)時(shí)需要將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品的相鄰泳道同時(shí)電泳或?qū)⒋郎y(cè)樣品與Maker 比較， 能比較SSR 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品的品種，數(shù)據(jù)精確度低，1～5 bp 差異不明顯，因此，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳比熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的等位基因和基因型數(shù)目少。 熒光毛細(xì)管電泳只分離檢測(cè)樣品， 不需要標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA， 但僅限于數(shù)據(jù)庫(kù)中已包含標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋的品種檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果精確，可以將1 bp 的差異明顯展示出來(lái)。 如P24 擴(kuò)增的待測(cè)樣品6 和8 均為雙帶，基因型為“233/238”和“232/238”，一條帶相同，另一條帶相差1 bp；P27 擴(kuò)增的待測(cè)樣品2 和樣品5 基因型為“271/297”和“271/294”，第 2 條帶相差 3 bp，圖 1 中凝膠圖譜差異均不明顯， 圖2 中熒光毛細(xì)管電泳可以清楚地觀察到差異， 因此熒光毛細(xì)管電泳方法樣品區(qū)分能力更強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)試驗(yàn)要求、 儀器設(shè)備的配備情況、 標(biāo)準(zhǔn)樣品及SSR 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的配置選擇電泳方法。 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適合區(qū)分差異較大的品種和小樣本量研究應(yīng)用，對(duì)儀器設(shè)備、試驗(yàn)條件要求較低，成本也低[7]；熒光毛細(xì)管電泳試驗(yàn)結(jié)果精確，能夠清晰區(qū)分品種間差異較小的樣本， 同時(shí)自動(dòng)化程度高，降低了人為誤差，可以實(shí)現(xiàn)樣品高通量、位點(diǎn)高通量檢測(cè)，工作效率更高，但成本也比較高。