曹 曦，孫艷玲，陳翠英，肖義煒，向?qū)捿x，劉學(xué)恩，莊 輝

1 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物系和感染病中心，北京 100191；2 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 肝病醫(yī)學(xué)中心肝病外科，北京 100853；3 江蘇先思達(dá)生物科技有限公司，南京 210000

HBV慢性感染是肝細(xì)胞癌 (HCC) 發(fā)生的最常見病因，HCC的發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別占第6位和第4位，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。HCC細(xì)胞異常增殖可使血清糖蛋白N-糖鏈組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此，血清糖蛋白的N-聚糖可作為HCC診斷標(biāo)志物和HCC治療的分子靶點[2]。N-聚糖改變的基礎(chǔ)在于肝細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶活性的變化，其中多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)與肝臟功能密切相關(guān)。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時，某些糖基轉(zhuǎn)移酶基因被激活，其表達(dá)異常增加，或基因表達(dá)受抑制而含量下降，從而導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)異常糖基化修飾。大量研究[3]表明，這種異常糖基化修飾與腫瘤細(xì)胞惡性侵襲行為密不可分。筆者前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，HBV相關(guān)HCC(HBV-HCC)患者血清中N-聚糖圖譜發(fā)生一系列特征改變，其中二天線N-聚糖峰1(peak1,NGA2F)豐度升高；三天線N-聚糖峰9(peak9, NA3Fb)豐度特異性升高；其他三天線和四天線N-聚糖峰(peak10 NA3Fc、peak11 NA4、peak12 NA4Fb)豐度也有不同程度的升高。但目前HBV-HCC患者血清N-聚糖變化機(jī)制尚未完全闡明。本研究中，通過檢測HBV-HCC患者癌組織與癌旁組織中8種重要的糖基轉(zhuǎn)移酶基因(包括巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT8和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Gn-TⅢ、Gn-TⅣa、Gn-TⅤ)表達(dá)水平變化并比較其差異，探索HBV-HCC患者血清N-聚糖變化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 肝組織標(biāo)本和血清標(biāo)本的收集 收集解放軍總醫(yī)院2018年9月—2019年11月HBV-HCC行手術(shù)患者的肝癌和癌旁組織及正常肝組織標(biāo)本，同時采集血清標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存?；颊叻弦韵氯脒x標(biāo)準(zhǔn): (1)均為感染HBV的HCC患者；(2)排除HAV、HCV、HDV、HEV等肝炎病毒感染；(3)患者術(shù)后病理標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院病理科確診為HCC，肝癌診斷符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)[5]。同時收集HCC患者臨床資料。另外選取20例健康成年人血清作為對照。

1.2 DSA-FACE法檢測HBV-HCC患者血清N-聚糖圖譜 應(yīng)用SPSS 20.0軟件從34例HCC患者中隨機(jī)選擇8例HCC患者血清標(biāo)本作為HCC試驗組，20例健康成年人血清標(biāo)本作為對照組。采用DSA-FACE法檢測和分析血清N-聚糖圖譜[6]，具體步驟如下：

(1)寡糖的釋放：取3 μl血清，加入含有2 μl 10 mmol/L NH4HCO3緩沖液和3 μl去離子水的PCR反應(yīng)板中, 反應(yīng)板放入PCR儀器，95 ℃加熱5 min 后冷卻至4 ℃,然后加入3 μl PNGaseF(2.2 U/μl)，37 ℃孵育3 h，之后加入100 μl去離子水終止反應(yīng)，標(biāo)記為D板。

(2)標(biāo)記寡糖：從D板吸取10 μl溶液加入一新的PCR反應(yīng)板中，開蓋在60 ℃條件下烘干90 min，加入3 μl標(biāo)記溶液(20 mmol/L APTS∶1 mol/L NaCNBH3=1∶1)，90 ℃反應(yīng)2 h，加入100 μl去離子水終止反應(yīng)，標(biāo)記為L板。

(3)去唾液酸：從L板中取2 μl溶液加入一新的PCR反應(yīng)板，加入0.25 μL 100 mmol/L NH4Ac(pH=5.0)、0.2 μl 唾液酸酶(2.5 U/μl)和1.55 μl去離子水, 震蕩混勻后42 ℃孵育4 h，加40 μl去離子水終止反應(yīng)，標(biāo)記為DE板。

(4)DNA 測序儀上機(jī)檢測：取DE板10 μl溶液加入ABI測序儀專用96孔板，放入ABI 3500 測序儀進(jìn)行N-聚糖圖譜分析，數(shù)據(jù)經(jīng) GeneMapper 軟件分析。

1.3 熒光定量PCR法檢測患者癌組織與癌旁組織中的糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平 凍存的肝組織放入超聲震蕩儀研磨后，用Trizol試劑提取總RNA，用Nano Drop One檢測總RNA的濃度和純度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用熒光定量PCR儀(ABI 7500 FAST)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件為：(1)95 ℃ 30 s；(2)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s共40個循環(huán)；(3)溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

以RPS11作為內(nèi)參基因，目的基因的相對表達(dá)量用2-△△CT表示。癌組織和癌旁組織糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對表達(dá)量檢測分析的對照均是正常肝組織。 FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT8、Gn-TⅢ、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因的特異引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR檢測糖基轉(zhuǎn)移酶基因引物序列表

1.4 蛋白印跡法檢測癌組織和癌旁組織中FUT8、Gn-TⅤ和Gn-Ⅳa的蛋白表達(dá)水平 凍存的肝組織放入超聲震蕩儀研磨后，用含cOmplete蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA蛋白試劑盒來測定蛋白濃度。電泳分離不同分子量蛋白后，15 V恒壓下用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入抗-FUT8(1∶1000)、抗-Gn-TⅣa(1∶1000)、抗-Gn-TⅤ(1∶1000)、抗-β-actin(1∶4000)一抗，4 ℃過夜，TBST溶液洗膜3次，分別加入抗鼠或抗兔的二抗(1∶5000)，室溫下孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，加入增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像儀掃描顯影的條帶，ImageJ軟件分析條帶灰度。以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白的相對表達(dá)量用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來表示。

2 結(jié)果

2.1 HBV-HCC患者臨床特征 34例HBV-HCC患者臨床特征見表2。

2.2 HBV-HCC患者血清N-聚糖圖譜特征 應(yīng)用DSA-FACE法分析HCC試驗組8例HBV-HCC患者與對照組20例健康成年人血清N-聚糖圖譜(圖1)，其特征改變與筆者前期研究發(fā)現(xiàn)的特征改變相同[4]。

與對照組相比，HCC試驗組患者三天線N-聚糖峰9(peak9，NA3Fb)豐度明顯升高(t=-2.514，P<0.05)；血清二天線N-聚糖峰1(peak1，NGA2F)和四天線N-聚糖峰(peak11 NA4、peak12 NA4Fb)的豐度在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

表2 34例HBV-HCC患者臨床特征

2.3 癌組織與癌旁組織8種糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平比較 癌組織中FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(1.50±0.34 vs 0.65±0.11,t=-2.354，P=0.022; 2.90±0.47 vs 1.68±0.19,t=-2.403，P=0.019; 3.57±0.64 vs 1.33±0.16,t=-3.384，P=0.001)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。FUT3、FUT4、FUT6、FUT7和Gn-TⅢ mRNA的表達(dá)水平在癌組織與癌旁組織間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(圖2)。

進(jìn)一步比較了HCC試驗組中8例患者癌組織與癌旁組織中8種糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平。與癌旁組織相比，8例HCC試驗組患者癌組織中Gn-TⅤ mRNA表達(dá)明顯升高(Gn-TⅤ:5.26±1.70 vs 1.49±0.33,t=-2.173,P=0.047)；Gn-TⅢ、Gn-TⅣa、FUT4 和FUT8 mRNA表達(dá)在癌組織與癌旁組織間無顯著性差異(Gn-TⅢ:1.03±0.46 vs 1.55±0.62,t=0.663,P=0.518；Gn-TⅣa: 5.15±1.50 vs 2.39±0.46,t=-1.752,P=0.102; FUT4: 1.56±1.12 vs 0.81±0.27,t=-0.653,P=0.524; FUT8: 2.61±1.26 vs 1.01±0.41,t=-1.213,P=0.245)。

2.4 癌組織和癌旁組織FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ基因的蛋白表達(dá)水平比較 選取mRNA表達(dá)有顯著性差異的3個糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ作為蛋白印跡實驗的檢測因子。結(jié)果如圖3所示，癌組織中FUT8與Gn-TⅤ的蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(0.70±0.11 vs 0.083±0.017,t=9.555,P=0.001; 1.33±0.19 vs 0.60±0.15,t=5.097,P=0.007)；Gn-TⅣa的蛋白表達(dá)水平在癌組織與癌旁組織間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.52±0.24 vs 0.24±0.11,t=1.833,P=0.141)。

注：a，血清中12種N-聚糖豐度比較；b，12種N-聚糖結(jié)構(gòu)。Peak1-Peak12圖引自文獻(xiàn)[4]，Peak1: 二天線無半乳糖基核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NGA2F)；Peak2: 二天線無半乳糖基核心ɑ-l,6巖藻糖基化平分型N聚糖(NGA2FB)；Peak3/Peak4: 二天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化單支鏈半乳糖基N聚糖(NG1A2F)；Peak5: 二天線N聚糖(NA2)；Peak6: 二天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA2F)；Peak7: 二天線平分型核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA2FB)；Peak8: 三天線N聚糖(NA3)；Peak9: 三天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化N聚糖(NA3Fb)；Peak9’: 三天線核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA3Fc)；Peak10: 三天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化與核心ɑ-l,6巖藻糖基化N聚糖(NA3Fbc)；Peak11: 四天線N聚糖(NA4)；Peak12: 四天線支鏈ɑ-l,3巖藻糖基化N聚糖(NA4 Fb)。

注：*，P<0.05，**，P<0.01。圖2 癌組織與癌旁組織中8種糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平比較

注：**，P<0.01圖3 癌組織與癌旁組織糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8、Gn-TⅣa和Gn-TⅤ的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

HCC患者血清中常出現(xiàn)大量異常糖基化N-糖蛋白，分離糖蛋白的N-聚糖鏈進(jìn)行表達(dá)圖譜分析，可發(fā)現(xiàn)支鏈與核心巖藻糖基化N-聚糖和多天線N-聚糖含量增加，這些N-聚糖與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為篩查和診斷HCC的特異性標(biāo)志[12]。研究[4,13]發(fā)現(xiàn)在HBV-HCC患者血清中支鏈巖藻糖基化三天線N-聚糖(peak9, NA3Fb)豐度顯著升高，且核心巖藻糖基化二天線N-聚糖(peak1,NGA2F)、核心巖藻糖基化平分型二天線N-聚糖(peak2,NGA2FB)、支鏈與核心巖藻糖基化三天線N聚糖(peak10,NA3Fc)、四天線N-聚糖(peak11,NA4)和支鏈巖藻糖基化四天線N-聚糖(peak12,NA4Fb)豐度也有不同程度的升高(N-聚糖結(jié)構(gòu)如圖4)。本研究通過對HBV-HCC患者癌組織與癌旁組織相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)檢測分析，探尋HCC患者特異性血清N-聚糖變化的可能機(jī)制。

糖基轉(zhuǎn)移酶Gn-TⅤ與Gn-TⅣa催化形成三天線及三天線以上N-聚糖的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖鏈結(jié)構(gòu)[14-15]，而Gn-TⅢ催化合成N-聚糖的平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)，Gn-TⅢ與Gn-TⅤ、Gn-TⅣa有拮抗作用(圖4)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在癌組織中Gn-TⅤ與Gn-TⅣa mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，蛋白印跡實驗也顯示，在癌組織中Gn-TⅤ蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。而Gn-TⅢ mRNA表達(dá)水平在癌組織與癌旁組織間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.711)。本研究結(jié)果可以解釋HCC試驗組患者血清中N-聚糖變化：與對照組相比，8例HCC患者血清中三天線N-聚糖(peak9)豐度顯著升高(P<0.05)，而且這8例HCC患者癌組織Gn-TⅤ表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。說明HCC患者血清中多天線N-聚糖豐度升高可能與糖基轉(zhuǎn)移酶Gn-TⅤ高水平表達(dá)密切相關(guān)，促進(jìn)含GlcNAc多分支(三天線及以上)N-聚糖的合成(圖4)。

以往研究[4,13]表明，在HBV-HCC患者血清中核心巖藻糖基化N-聚糖(peak1、peak2、 peak10)豐度較高。本研究發(fā)現(xiàn)，在癌組織中核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。FUT8表達(dá)上調(diào)會導(dǎo)致核心巖藻糖基化修飾結(jié)構(gòu)的N-聚糖增加，可能與癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)[17]。另外，AFP是臨床上最常用的HCC血清學(xué)檢測指標(biāo)，有研究[18]發(fā)現(xiàn)HCC患者血清中AFP經(jīng)FUT8催化作用下可形成核心巖藻糖基化AFP(AFP-L3)，其與腫瘤的發(fā)展速度、腫瘤大小和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且診斷HCC效力優(yōu)于AFP。除了α-1,6核心巖藻糖基化N-聚糖，α-1,3分支巖藻糖基化N-聚糖的豐度在HBV-HCC患者血清也特異性升高。α-1,3分支巖藻糖基化結(jié)構(gòu)是三天線N-聚糖(peak9)中Lewis X結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵[4]，參與合成α-1,3分支巖藻糖基化結(jié)構(gòu)且與HCC密切相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7[19]。本研究顯示，在34例HCC患者癌組織與癌旁組織間FUT3、FUT4、FUT6和FUT7 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)，不能解釋血清N-聚糖水平異常改變。結(jié)合以往研究報道分析FUT基因表達(dá)的檢測結(jié)果，可能因為多種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶參與合成α-1,3分支巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，而目前對于這些酶相互作用機(jī)制尚未明確，較難判斷巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶中那一種亞類起主導(dǎo)作用。本研究主要檢測8種與HCC密切相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)，初步闡述HBV-HCC患者血清中N-聚糖變化的可能機(jī)制。但對于不同糖基轉(zhuǎn)移酶之間相互作用的具體機(jī)制以及其他血清N-聚糖(如異常唾液酸化修飾的N-聚糖等)變化機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

圖4 HBV相關(guān)HCC患者血清特異變化N-聚糖與8種糖基轉(zhuǎn)移酶之間的關(guān)系

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：曹曦完成實驗和數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；孫艷玲、肖義煒、向?qū)捿x參與收集標(biāo)本和分析數(shù)據(jù)；陳翠英參與修改論文；劉學(xué)恩、莊輝負(fù)責(zé)課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。