李夢(mèng)琪，焦龍杏，郭嘉欣，尚 靜，徐遠(yuǎn)義，黃允寧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，銀川 750001）

胃癌是全球最常診斷的癌癥之一[1]。轉(zhuǎn)移是胃癌高病死率的主要原因，而腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制之一[2]。目前胃癌的治療以手術(shù)和化療為主[3]，但效果并不理想。因此，開發(fā)有效的抗腫瘤藥物抑制人胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT對(duì)胃癌的治療具有重要意義。硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一種帶有硫酸根的多糖，具有腹腔吸收緩慢，作用時(shí)間持久的特點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該分子質(zhì)量的DS可以抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和粘附，并減少腹腔種植轉(zhuǎn)移[4]。然而，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。高遷移率族蛋白AT2（HMGA2）是一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，屬于高遷移率族蛋白家族成員之一。據(jù)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析HMGA2在腫瘤中高表達(dá)，并且在胃癌患者組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。有文獻(xiàn)[5-6]研究顯示，前列腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌中HMGA2與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，研究表明，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中microRNA-98通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin途徑靶向HMGA2抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的遷移和侵襲[7]。因此，探究以HMGA2/β-catenin為靶點(diǎn)的研究，對(duì)胃癌的治療具有積極的意義。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討DS是否可以影響人胃癌細(xì)胞HMGA2/βcatenin的表達(dá)并抑制人胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌標(biāo)本 收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018年10月至2019年10月經(jīng)手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為胃腺癌的組織標(biāo)本24例，所有患者術(shù)前均未接受放療及化學(xué)藥物治療。

1.1.2 細(xì)胞與動(dòng)物 人胃癌細(xì)胞株HGC-27，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)肝脾外科實(shí)驗(yàn)室蔣寒冰贈(zèng)予。BALB/c裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司［動(dòng)物牌照號(hào)SCXX（Jing）2006-0009］，5～6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g。在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)步驟已通過寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。1.1.3藥物與試劑DS分子質(zhì)量500000 Da，購自美國Sigma公司。HMGA2、β-catenin、E-cad單克隆一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；N-cad一抗購自中國博奧森公司；β-actin抗體、山羊抗兔和鼠二抗均購自中杉金橋技術(shù)有限公司；胎牛血清購自Bioind公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；兔二步法檢測(cè)試劑盒（PV-9001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）試劑購自TaKaRa公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS與1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 免疫組化染色采用二步法。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片烤干，二甲苯及梯度濃度的乙醇溶液脫蠟、脫水、抗原修復(fù)，封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化，脫水，封片。顯微鏡觀察陽性染色分布特點(diǎn)，選定具有代表性的5個(gè)視野拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，平均光密度值=陽性染色組織積分光密度（IOD）/面積（area）。

1.2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將HGC-27細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿孔底，用無菌移液器槍頭在6孔板底部進(jìn)行“一”字形劃痕，PBS洗3次后對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)基，DS組加入含0.3% DS的無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察0、24 h后細(xì)胞的愈合情況并拍照。沿劃痕邊緣取3處測(cè)量劃痕寬度，取平均值。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度－觀察時(shí)間劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 采用預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的8μm規(guī)格的聚碳酸酯濾膜培養(yǎng)小室，進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)；采用同樣規(guī)格未鋪基質(zhì)膠的小室進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。將HGC-27細(xì)胞制成1×105/mL密度的細(xì)胞懸液，接種200μL細(xì)胞懸液到Transwell小室的上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕擦拭上室，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)為每組穿過小室的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot將0、12和24 h收集的細(xì)胞加入裂解液冰上裂解，用BCA蛋白定量試劑盒定量。等量蛋白（50μg）上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（6%～15%），常規(guī)濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，對(duì)應(yīng)抗體4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，二抗孵育室溫2 h，滴入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，AmershamImager 600儀器曝光。應(yīng)用ImageJ軟件測(cè)量各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，用各時(shí)間點(diǎn)目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達(dá)灰度值的比值來表示相對(duì)蛋白量，用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各時(shí)間點(diǎn)比較，Graphpadprism 8.0繪制柱狀圖。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047）說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用TBGreen法（TaKaRa，RR820）以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行RTqPCR，引物序列見表1。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，記錄CT值，用2-△△CT方法計(jì)算基因的表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.7 構(gòu)建裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移模型BALB/c裸鼠在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF條件下飼養(yǎng)，可自由獲取無菌食品和水。24只隨機(jī)分為對(duì)照組、DS組（0.3% DS干預(yù)），每組12只，調(diào)整HGC-27細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，取0.2 mL細(xì)胞懸液注射于裸鼠腹腔。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。術(shù)后第14天，采用脫頸法處死裸鼠，然后觀察腹腔內(nèi)特別是網(wǎng)膜內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量、大小、顏色。收集大網(wǎng)膜組織經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水預(yù)滅菌處理，-80℃冷凍，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0和Graphpad prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGA2、β-catenin、N-cad和E-cad在人胃癌組織中的表達(dá)

人胃癌組織免疫組化結(jié)果顯示，癌組織中HMGA2主要呈棕黃色分布于細(xì)胞核；β-catenin、N-cad在胃癌細(xì)胞胞漿呈棕黃色分布，而在癌旁正常組織中染色均弱于癌組織；E-cad呈棕黃色線性分布于癌旁正常組織的細(xì)胞膜，而癌組織染色減少。癌組織中HMGA2、β-catenin、N-cad表達(dá)均高于癌旁正常組織，而E-cad表達(dá)則低于正常組織（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 HMGA2、β-catenin、E-cad和N-cad在人胃癌組織中的表達(dá)

2.2 DS抑制人胃癌細(xì)胞的劃痕愈合能力

HGC-27細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DS干預(yù)24 h后HGC-27細(xì)胞的劃痕愈合能力受到抑制（P＜0.01），提示DS可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。見圖2。

圖2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察0和24 h光鏡下劃痕愈合能力

2.3 DS抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27的遷移和侵襲

Transwell結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DS干預(yù)24 h后HGC-27細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＜0.01），同樣在DS干預(yù)24 h后HGC-27細(xì)胞侵襲數(shù)量較對(duì)照組減少（P＜0.01），表明DS可以抑制HGC-27細(xì)胞的遷移和侵襲能力。見圖3A、B。

圖3 DS抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27的遷移和侵襲

2.4 Western blot與RT-qPCR檢測(cè)人胃癌細(xì)胞HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達(dá)

在DS干預(yù)人胃癌細(xì)胞第0 h DS組HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而12、24 h DS組HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白水平均低于對(duì)照組（P均＜0.05）；E-cad的表達(dá)在12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在24 h DS組蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖4A、B。DS干預(yù)24 h后提取總RNA進(jìn)行RT-qPCR分析，與對(duì)照組相比，DS可以減少HMGA2、β-catenin、N-cad的表達(dá)（P＜0.05），而增加E-cad的表達(dá)（P＜0.01）。見圖4C。

圖4 DS干預(yù)HGC-27細(xì)胞后各因子蛋白和mRNA的表達(dá)

2.5 建立裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移模型

通過腹腔種植轉(zhuǎn)移模型可觀察到裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)呈瓷白色，質(zhì)地堅(jiān)硬；對(duì)照組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于DS組，且腫瘤結(jié)節(jié)體積較DS組大。見圖5。

圖5 腹腔種植轉(zhuǎn)移模型觀察腹腔轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量

2.6 Western blot檢測(cè)裸鼠大網(wǎng)膜組織HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達(dá)

在裸鼠組織中DS干預(yù)后HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組（P＜0.01），而Ecad在DS干預(yù)后表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖6A、B。

圖6 目的因子在裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤模型大網(wǎng)膜中蛋白表達(dá)水平

3 討論

胃癌是一種高患病率、高病死率的疾病。鑒于胃癌轉(zhuǎn)移是胃癌高病死率的主要原因之一，所以研究有效的抗腫瘤藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移提高患者存活率具有重要意義。

DS屬于右旋糖苷的衍生物，其生物活性與其分子質(zhì)量有關(guān)。有研究[8]表明，分子質(zhì)量在1000 Da到10000 Da的DS可以抑制HIV病毒的活性。而分子質(zhì)量在10000 Da到40000 Da時(shí)，DS可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的電荷減少細(xì)胞聚集，提高干細(xì)胞產(chǎn)量，并可以通過減少透明質(zhì)酸酶的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力[9-10]。本課題組選用的DS分子質(zhì)量為500000 Da，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)該分子質(zhì)量的DS可以抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和粘附，并減少腹腔種植轉(zhuǎn)移[4]。然而，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

HMGA2是一種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，屬于HMGA蛋白家族。HMGA蛋白的特征是含有3個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域，稱為AT-hooks和一個(gè)酸性羧基末端，其可以通過與DNA中AT富集區(qū)域結(jié)合而改變DNA構(gòu)象調(diào)控基因表達(dá)，從而影響包括細(xì)胞生長、增殖、分化和死亡在內(nèi)的一系列生物過程[11]。HMGA2在胚胎期以及不成熟組織中高度表達(dá)[12]，但在正常的成年組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而研究顯示在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌[7，13-15]中HMGA2均有過表達(dá)。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，當(dāng)上游因子激活Wnt信號(hào)通路后胞質(zhì)內(nèi)β-catenin不能正常降解而富集轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，在胞核內(nèi)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[16]，然而Wnt信號(hào)通路是EMT的關(guān)鍵通路之一。HMGA2與Wnt信號(hào)通路關(guān)系密切，Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-98通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin途徑靶向HMGA2抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的遷移和侵襲；Dai等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p通過靶向HMGA2調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，在胃癌中HMGA2/β-cantenin可能成為治療靶點(diǎn)。

EMT在胚胎形成和發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[18]，而在腫瘤發(fā)展過程中EMT作為關(guān)鍵步驟參與腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。腫瘤在體內(nèi)轉(zhuǎn)移過程分為：腫瘤細(xì)胞從腫瘤原發(fā)灶分離并發(fā)生遷移，穿透基底膜，進(jìn)入血液或淋巴管，從血液或淋巴管流出，最后形成轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)[20]。然而，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移起始階段，通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的流動(dòng)性、侵襲性和對(duì)凋亡刺激的抵抗力促使腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)灶開始尋找原發(fā)灶以外適合生存的器官，即腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[21]。因此，EMT被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)志，而研究通過抑制EMT治療腫瘤可以作為腫瘤治療的新策略[22]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的同時(shí)會(huì)伴隨細(xì)胞內(nèi)的分子改變，例如，上皮標(biāo)記物（E-cad）表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)記物（N-cad、vimentin）表達(dá)增加，這些標(biāo)志性的分子改變會(huì)有助于判斷EMT發(fā)生與否。Liu等[23]研究證明Tiam1通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移。

本研究對(duì)24例胃癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：癌組織中HMGA2、β-cantenin、N-cad表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；而癌組織中E-cad表達(dá)明顯弱于正常組織。推測(cè)在胃癌中HMGA2、Wnt信號(hào)通路與EMT之間是否存在聯(lián)系，DS是否可以影響這一過程。為驗(yàn)證猜想進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)的研究，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DS干預(yù)24 h后細(xì)胞的遷移能力減弱，表明DS可抑制人胃癌細(xì)胞的橫向遷移能力。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示DS干預(yù)24 h后發(fā)生侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，證明DS可抑制人胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為進(jìn)一步探討DS作用的分子機(jī)制，選取HGC-27細(xì)胞進(jìn)行Western blot和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示DS干預(yù)24 h后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯減弱，而E-cad表達(dá)顯著增強(qiáng)。以上體外研究結(jié)果顯示：DS可以抑制人胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并使HMGA2、β-cantenin、N-cad表達(dá)減弱，而E-cad表達(dá)增強(qiáng)。為了繼續(xù)探索DS的作用機(jī)制，本研究進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在已建立裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移模型中可以觀察到對(duì)照組裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)呈瓷白色，質(zhì)地堅(jiān)硬；并且對(duì)照組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量多于DS組，且腫瘤結(jié)節(jié)體積較DS組大。取DS組與對(duì)照組裸鼠的大網(wǎng)膜組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表達(dá)情況，結(jié)果表明DS組經(jīng)過DS干預(yù)后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表達(dá)明顯受到抑制，但是DS促進(jìn)了E-cad的表達(dá)，此結(jié)果與體外Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)DS可以抑制HMGA2/β-catenin，并且影響人胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT，提示HMGA2/β-catenin可能是DS發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用的新靶點(diǎn)。

綜上所述，DS可以下調(diào)HMGA2/β-cantenin信號(hào)抑制人胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT。其中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)本研究為后續(xù)探究DS抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供新的思路。