劉 通，楊 麗，陳 贏，唐 靜，林 源，馬國榮，楊延輝

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一種慢性傳染性疾病，亦是全球十大死亡原因之一。它的病原體是結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。2019年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的TB報告顯示，全球約25%的人口曾感染過MTB，每年約有1000萬人患TB，約145萬人死亡[1]。如果診斷及時，用一線抗結(jié)核藥物經(jīng)過6個月的治療，大多數(shù)肺結(jié)核患者可以治愈，但耐藥TB仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2017年新發(fā)TB患者對利福平（rifampin，RIF）耐藥人數(shù)達(dá)55.8萬，其中82%發(fā)展為耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）[2-4]。傳統(tǒng)認(rèn)為RIF的耐藥基因主要為rpoB、rpoC、rpoA及rpoZ，但耐藥形成的分子機(jī)制報道較少[5-9]。本文用Illumina HiseqTM3000高通量測序平臺對1/2最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的RIF處理前后MS MC2155的總RNA進(jìn)行測序，通過比對篩選獲得差異表達(dá)基因（difference expressed gene，DEG），并對DEG的功能進(jìn)行聚類富集分析發(fā)現(xiàn)，使用RIF后能調(diào)控分枝桿菌萬古霉素耐藥、氧化磷酸化和共生體調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步探討RIF耐藥機(jī)制的形成過程及尋找潛在的新型抗耐藥MTB的靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及主要試劑

MS MC2155由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所肖春玲研究員惠贈。7H9、7H10培養(yǎng)基、OADC（美國BD公司）；RIF、刃天青（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）。

1.2 主要儀器

37℃培養(yǎng)箱（上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司，HF240）；酶標(biāo)儀（Thermo Scientific-Multiskan GO）；紫外分光光度計（上海光明電子儀器廠，721型）；臺式高速冷凍離心（德國Eppendorf公司，5424 R）；生物安全柜（Heal Forec力康生物技術(shù)有限公司，900B2）；高壓滅菌鍋（Tomy Digital Biology公司，SX-500）；核酸電泳儀和紫外切膠儀（北京六一儀器廠，WD-9403F）；恒溫?fù)u床（上海旻泉儀器有限公司，LPL-24）；核酸凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+）。

1.3 刃天青法測定RIF對MS MC2155的MIC

MS MC2155菌株于7H10培養(yǎng)基中劃線涂板，37℃溫箱培養(yǎng)72 h，挑取單克隆接種于5 mL 7H9培養(yǎng)基中，在37℃、200 r·min-1的搖床中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用分光光度計測得OD600=0.68。將MS MC2155菌液按1∶1000的比例稀釋于7H9培養(yǎng)基中。取兩個96孔板，在其最外一周各孔加入100μL的7H9培養(yǎng)基，在兩個96孔板的B2、F2孔各加2.56μL的RIF（濃度10 mg·mL-1）和187.44μL稀釋后的菌液，并吹打混勻，其余各孔均加入90μL稀釋后的菌液，取B2混合液100μL于B3孔吹打混勻，再取B3混合液100μL于B4孔吹打混勻，依此類推，B11中棄去100μL；F行方法同B行。加樣完成后將96孔板放入37℃恒溫箱孵育24 h后取出，在每孔中均加入10μL 10%的刃天青，再次放入37℃恒溫箱孵育6 h，取出觀察、拍照并用酶標(biāo)儀測定。

1.4 用1/2 MIC濃度的RIF處理MS MC2155后制備RNA-seq樣品

挑取MS MC2155單克隆接種于5 mL 7H9培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h。取上述0.2 mL菌液分別接種于4瓶200 mL的7H9培養(yǎng)基中，在其中3瓶中各加入80μL濃度10 mg·mL-1的RIF儲存溶液，并用相同體積的DMSO溶液設(shè)立空白對照組，依照上述方法平行實驗3次，于37℃，200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)72 h。5000×g離心10 min，收集菌泥凍存于-80℃環(huán)境。

1.5 提取MS MC2155菌株的總RNA

用Trizol（TaKaRa，T9108）試劑提取細(xì)菌的總RNA，并用DNaseI（TaKaRa，D2215）去除樣品中的DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop（Agilent Technologies，美國）檢測RNA質(zhì)量和完整性，使用QubitR 2.0 Flurometer（Life Technologies，美國）測定總RNA濃度。

1.6 構(gòu)建cDNA文庫并測序

將得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄一鏈的合成，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄二鏈的合成和末端修復(fù)。在末端修復(fù)產(chǎn)物cDNA的3'末端加堿基A，加測序接頭。鏈接產(chǎn)物經(jīng)膠回收后進(jìn)行PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收。文庫構(gòu)建完成后，分別使用QubitR2.0和Agilent 2100對文庫的濃度和插入片段大小進(jìn)行檢測，使用q-PCR法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。建好的文庫采用Illumina 3000測序平臺，2×151測序模式進(jìn)行測序。

1.7 組裝測序數(shù)據(jù)并注釋基因功能

利用FPKM（Fragments Per Kilobase per Million reads）方法計算基因的表達(dá)量，利用DESeq2軟件針對有重復(fù)樣本的不同樣本組之間篩選差異表達(dá)基因，利用DESeq 2軟件針對無重復(fù)樣本的不同樣本組之間篩選差異表達(dá)的已知基因，以|log2FC|≥1和P≤0.05為閾值，篩選兩組之間的差異基因。

1.8 差異表達(dá)基因的GO和KEGG功能富集分析

把所有得到的差異表達(dá)基因和背景基因映射到GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org），計算每個條目的基因數(shù)目，采用超幾何檢驗方法得到P值，并將差異基因進(jìn)行GO注釋，找出與整個基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。以P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)、細(xì)胞、分子功能。并將差異表達(dá)基因序列在KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）中進(jìn)行注釋，同樣的方法得到P值。以P≤0.05為閾值，通過pathway分析確定差異表達(dá)基因的顯著性富集通路。

1.9 核心DEG的互作分析

利用在線數(shù)據(jù)庫STRING（http://string-db.org）篩選存在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction，PPI）的DEGs。利用Cytoscape軟件（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步分析候選DEGs編碼蛋白在MS MC2155中的相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 RIF對MS MC2155的MIC

使用刃天青法經(jīng)過3次生物學(xué)重復(fù)，測得RIF對MS MC2155菌株的MIC值為8μg·mL-1。分別使用4、6μg·mL-1的RIF培養(yǎng)MS MC2155菌株，發(fā)現(xiàn)6μg·mL-1的RIF導(dǎo)致細(xì)菌生長速度極慢，樣品量不足，最終確定RNA-seq的藥物處理濃度為4μg·mL-1。

2.2 RNA質(zhì)量和完整性

圖1顯示出三條清晰的條帶、無雜帶、無拖尾或彌散現(xiàn)象，說明RNA樣本其大小和條數(shù)有物種特異性，無降解情況，不含其他雜質(zhì)，OD260/OD280=2.13，滿足測序要求。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量與評估

表1是MS MC2155與RIF處理后MC2155的原始序列和預(yù)處理序列的統(tǒng)計結(jié)果和Reads的參考基因組比對分析統(tǒng)計結(jié)果；CGC1~3是指MS MC2155樣品名稱，CGL1~3是指RIF處理后MS MC2155樣品名稱。利用FastQC軟件對預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析，結(jié)果顯示測序樣品Q20的質(zhì)量值為97.79%~98.85%，滿足進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 樣品質(zhì)量檢測（%）

2.4 DEGs表達(dá)水平比對分析結(jié)果

對RIF處理后的MC2155與野生型差異表達(dá)結(jié)果分析如圖2所示，A為差異基因火山圖，B為差異基因散點(diǎn)圖。共832個基因的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.05，|log2FC|≥1），其中457個上調(diào)，375個下調(diào)。差異倍數(shù)在10倍以上的基因有76個，其中41個下調(diào)，35個上調(diào)。差異基因主要集中在萬古霉素耐藥、氧化磷酸化及氮代謝等通路中，其中萬古霉素耐藥差異表達(dá)基因有190個，氧化磷酸化差異表達(dá)基因有23個，氮代謝差異表達(dá)基因有9個。表2為差異倍數(shù)在10倍以上的部分DEGs，其中nrdB、mysB、ruvC、proW、sigM和cspA屬萬古霉素耐藥通路相關(guān)基因；nuoF和nuoB屬氧化磷酸化通路相關(guān)基因。

圖2 RIF處理MC2155后的差異表達(dá)基因分析

2.5 GO和KEGG功能富集分析結(jié)果

對RIF處理后的恥垢分枝桿菌差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析（圖3）。在GO數(shù)據(jù)庫中，表達(dá)基因根據(jù)功能分為生物學(xué)過程（biological process），細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）三大類，其中氧化還原酶活性、呼吸鏈復(fù)合物等分子功能以及外來生物刺激、共生體調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程是差異表達(dá)基因最多的路徑。對RIF處理后的恥垢分枝桿菌差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析（圖4）。結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要集中在萬古霉素耐藥（vancomycin resistance）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）通路。

表2 利福平處理后的主要差異基因

圖3 RIF處理MS MC2155后的差異表達(dá)基因GO富集柱狀圖

圖4 KEGG差異表達(dá)基因富集

2.6 核心DEG的互作分析結(jié)果

STRING分析結(jié)果顯示，共有371個差異基因編碼的蛋白質(zhì)存在相互作用，圖5A為其中50個中心節(jié)點(diǎn)基因。圖5B為差異倍數(shù)在10倍以上且存在互作關(guān)系的典型基因，其中MS0559為cspA。這些基因的異常表達(dá)可能在利福平調(diào)控中具有重要作用。

圖5 顯著差異基因所表達(dá)蛋白的互作分析

2.7 nrdB提示RIF治療結(jié)核的可能機(jī)制與潛在耐藥靶標(biāo)

STRING檢索發(fā)現(xiàn)顯著差異基因sigM、mysB和rplM確與rpoB存在密切關(guān)聯(lián)（圖6A），但RIF處理后分枝桿菌nrdB基因表達(dá)量降低超過16倍，gmk和guaB等核苷酸代謝相關(guān)基因表達(dá)同樣顯著降低，這說明RIF可能通過降低nrdB的表達(dá)來抑制核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸，減少DNA合成所需原料，從而直接阻斷分枝桿菌DNA及蛋白的合成。且STRING檢索表明nrdB、gmk和guaB存在明顯互作關(guān)系（圖6B）。提示nrdB可能是一個全新的RIF治療及耐藥關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3 討論

TB治療的難題在于日益嚴(yán)重的TB耐藥性，然而常用一線抗結(jié)核藥物RIF的耐藥基因是如何形成的尚不明了[10-11]。在分枝桿菌的作用機(jī)制研究中，MS與MTB的基因同源性高，生長速度快，生物安全要求低，在新型藥物開發(fā)和耐藥機(jī)制研究方面是MTB研究的理想模式菌之一[12-13]。RIF是首選的一線抗結(jié)核藥物，臨床中常采取聯(lián)合用藥的方式加強(qiáng)療效，也同時避免單用易產(chǎn)生耐藥性的問題[3，14-15]。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）指利用高通量測序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行深度測序的一項技術(shù)。它能從整體水平上更加全面地揭示藥物干預(yù)后細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境所發(fā)生的基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，有利于篩選發(fā)現(xiàn)RIF干預(yù)MS后所調(diào)控的基因[16-18]。

圖6 RpoB和nrdB相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

有研究結(jié)果顯示，RIF耐藥的分子機(jī)制涉及多個生物合成網(wǎng)絡(luò)和途徑中的多個基因[19-20]。RIF的作用機(jī)制目前認(rèn)為是RIF與依賴DNA的RNA多聚酶的β亞單位牢固結(jié)合，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過程，使DNA和蛋白的合成停止；RIF還可以通過抑制酪氨酸酶活性來抑制細(xì)菌的生長[21-23]。RpoB是一種DNA依賴的RNA聚合酶，nrdB是一種核糖核苷二磷酸還原酶。RIF通過與rpoB結(jié)合，干擾DNA轉(zhuǎn)錄和RNA延伸，從而抑制分枝桿菌生長；而RIF耐藥也與rpoB結(jié)合位點(diǎn)突變密切相關(guān)[21-23]。目前認(rèn)為rpoB基因突變是RIF耐藥的主要原因，其中最常見的突變密碼子是531、526和516[22]。但在耐藥基因的發(fā)生和發(fā)展方面尚無更全面的整體性研究。

本研究首次使用RIF在模式菌MS MC2155構(gòu)建了細(xì)菌的RNA-seq cDNA文庫，經(jīng)全轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了cspA、sigM、nrdB、nuoF、nuoB和mysB等表達(dá)水平差異較大的基因，與已知的耐藥基因rpoB、rpoC、rpoA及rpoZ等完全不同。通過同MS MC2155的參考基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)RIF有類似于萬古霉素的作用機(jī)制。研究表明，本文篩選得到的nrdB可與nrdA共同催化核糖核苷酸還原成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸，該基因的低表達(dá)可直接影響細(xì)菌DNA的合成[24]；nuoF和nuoB同屬醌氧化還原酶亞基，均為NDH-1的外圍臂組成部分，在NDH-1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，該基因的低表達(dá)可直接影響NADH脫氫酶片段的組裝，引起分枝桿菌的能量傳遞紊亂[25-27]；sigM屬于RNA聚合酶因子，能調(diào)節(jié)Esx分泌的蛋白質(zhì)和非核糖體肽合成酶基因，并向下調(diào)節(jié)與毒力相關(guān)的表面脂質(zhì)合成，該基因的高表達(dá)可降低分枝桿菌毒性[28-30]；cspA屬于冷休克蛋白，能調(diào)控細(xì)菌對低溫的適應(yīng)、影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的形成以及調(diào)控RIF的藥敏，研究表明，結(jié)核分枝桿菌的cspA是一種分泌蛋白，能引起細(xì)胞免疫，是一種可能的T細(xì)胞抗原[31-33]。以上新的關(guān)鍵基因的獲得為研究RIF影響分枝桿菌所涉及的早期調(diào)控分子機(jī)制提供了全新的靶標(biāo)分子。