賴生平，楊洪偉，徐志磊，聶明建，*

(1.重慶德潤(rùn)環(huán)境有限公司，重慶 400000；2.中國(guó)市政工程中南設(shè)計(jì)研究總院有限公司，湖北 武漢 430000)

0 引言

隨著城市化和經(jīng)濟(jì)水平的不斷提升，城市人口數(shù)量快速增長(zhǎng)，隨之而來的城市生活垃圾的污染問題日益嚴(yán)重，如何妥善處置城市生活垃圾是世界各國(guó)面臨的難題。我國(guó)城市生活垃圾的主要處置方法有焚燒、堆肥和衛(wèi)生填埋。衛(wèi)生填埋是20年前垃圾處置的最主要方法，但由于其選址十分嚴(yán)苛，并且對(duì)地下水、土壤、大氣等均具有較大的污染，給生態(tài)系統(tǒng)帶來了極大的威脅(王傳英等[1])。為使填埋技術(shù)成為減少垃圾污染的一種技術(shù)方案，可采用準(zhǔn)好氧填埋技術(shù)來改造老式厭氧填埋場(chǎng)或新建準(zhǔn)好氧填埋場(chǎng)，更好地抑制垃圾填埋場(chǎng)中液體和氣體污染物的產(chǎn)生?！皽?zhǔn)好氧填埋”的概念最初是由日本學(xué)者Hanashima教授提出的(Lee等[2])，近年來在中國(guó)得到廣泛推廣(Wu等[3])。這項(xiàng)技術(shù)從填埋場(chǎng)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出發(fā)，通過改造填埋場(chǎng)使內(nèi)部存在好氧、微氧、厭氧并存的環(huán)境，促使垃圾能在不同條件下實(shí)現(xiàn)不同途徑的污染物降解。準(zhǔn)好氧填埋場(chǎng)中，空氣可以通過滲濾液導(dǎo)排管擴(kuò)散入填埋場(chǎng)中，使填埋場(chǎng)從上自下形成好氧-微氧-厭氧-好氧的分布。填埋場(chǎng)中厭氧層是形成甲烷和氨氮的最主要場(chǎng)所，而甲烷在向上擴(kuò)散的過程中，在經(jīng)過微氧和好氧層時(shí)，好氧甲烷氧化菌會(huì)利用其代謝特性來氧化甲烷，是垃圾填埋場(chǎng)中最重要的甲烷減排生物活動(dòng)。氨氮在向下滲流的過程中，經(jīng)過準(zhǔn)好氧填埋場(chǎng)的底層好氧層，易被硝化細(xì)菌氧化為硝酸鹽，滲濾液中的有機(jī)物也會(huì)部分被好氧降解。然而，滲濾液中的有機(jī)質(zhì)和氮源尚未徹底去除，因此，通過滲濾液回灌的形式，將填埋場(chǎng)視作大型生物反應(yīng)器而進(jìn)一步去除污染物。回灌滲濾液中的氨氮進(jìn)一步在表層好氧層中被氨氧化，和填埋場(chǎng)中擴(kuò)散的甲烷將有可能在缺氧和微氧層相遇，實(shí)現(xiàn)甲烷氧化和反硝化的耦合。

不同類型的甲烷氧化耦合反硝化作用可能在不同的氧氣條件下發(fā)生：(1)在含氧量約為5%的微好氧層中(Huang等[4])，好氧的甲烷氧化菌通過有氧呼吸氧化甲烷并產(chǎn)生中間有機(jī)物，進(jìn)一步作為反硝化菌的電子供體來實(shí)現(xiàn)反硝化，這個(gè)過程稱為微好氧甲烷氧化耦合反硝化(MAME-D)；(2)在微好氧和缺氧層界面(IMAN)，有限的氧氣通過甲烷發(fā)酵或以硝酸鹽為直接電子受體，執(zhí)行缺氧甲烷氧化耦合反硝化(HYME-D)。

因此，本研究在實(shí)驗(yàn)室模擬了準(zhǔn)好氧填埋場(chǎng)中的微好氧和缺氧環(huán)境，探究了甲烷氧化與反硝化是否耦合發(fā)生，并分析了參與這些過程的主要微生物。

1 材料和方法

1.1 垃圾樣品

本研究使用的垃圾樣品采集自中國(guó)重慶長(zhǎng)生橋垃圾填埋場(chǎng)，在5個(gè)不同的地點(diǎn)隨機(jī)采集兩個(gè)深度的樣品，深度約為70 cm和120 cm。來自同一深度的樣本被混合在塑料密封袋中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)不同深度的樣品分別進(jìn)行處理。

1.2 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用氣

本實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基為硝酸鹽無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NMS)，其組成為：KH2PO4200 mg/L、K2HPO4400 mg/L、CaCl2·2H2O 500 mg/L、MgSO4·7H2O 1 000 mg/L、FeSO4·7H2O 9.1 mg/L、NaNO3濃度在200～400 mg/L之間(Huang等[4])。

進(jìn)口氣體大約由70%的甲烷和0～30%的二氧化碳組成。微好氧反應(yīng)器添加5%的氧氣，缺氧反應(yīng)器添加1%的氧氣，對(duì)照組反應(yīng)器不加入氧氣(Huang等[4])，剩下的氣體比例用氬氣填充。

1.3 浸出床生物反應(yīng)器(LBB)的設(shè)置和運(yùn)行

用于序批實(shí)驗(yàn)的三個(gè)等尺寸反應(yīng)器主要由直徑13 cm的柱子、上流式氣體分配系統(tǒng)和下流式液體滲濾系統(tǒng)構(gòu)成，反應(yīng)原理見圖1。從取樣深度70 cm的樣品中取出4 kg的樣品接種到LBB2中，富集MAME-D相關(guān)微生物。從取樣深度120 cm的樣品中取出4 kg的樣品接種到LBB3中，富集HYME-D相關(guān)微生物。對(duì)照試驗(yàn)中，將70 cm深度的2 kg樣品和120 cm深度2 kg樣品混合后加入LBB1中。將接種物在浸出床生物反應(yīng)器中馴化培養(yǎng)60 d，使可溶性有機(jī)物消耗盡。在此之后，用氬氣吹脫浸出床生物反應(yīng)器中的空氣，并通入設(shè)置比例的甲烷/二氧化碳/氧氣，正式進(jìn)行序批實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)運(yùn)行參數(shù)設(shè)置詳見表1。根據(jù)200～400 mg/L的進(jìn)水硝酸鹽負(fù)荷設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，總共運(yùn)行近50 d，每天6個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2 min的同時(shí)進(jìn)水和曝氣，56 min的滲濾和2 min的出水。培養(yǎng)基進(jìn)水為2 L/d。溫度控制在30±1 ℃。壓力保持在大氣壓力。每天收集一次氣體和液體樣本。

圖1 生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)圖Fig.1 Design drawing of bioreactors

表1 實(shí)驗(yàn)各階段運(yùn)行參數(shù)設(shè)置

1.4 分析方法

1.5 DNA提取、PCR擴(kuò)增以及高通量測(cè)序

從序批實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束，分別取三個(gè)反應(yīng)器各階段樣本各一個(gè)進(jìn)行DNA分離。使用TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA聚合酶和細(xì)菌通用引物515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。最后，用羅寧生物有限公司高通量測(cè)序儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)測(cè)序(2×250 bp)。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲烷氧化與反硝化耦合的證據(jù)

三階段運(yùn)行期間三套反應(yīng)器中硝酸鹽和甲烷濃度變化如圖2所示。總體來說，在LBB2和LBB3中成功地實(shí)現(xiàn)了甲烷氧化耦合硝酸鹽反硝化。在LBB2中，觀察到大量的甲烷消耗，并且硝酸鹽的消耗程度與甲烷消耗程度保持一致。每階段運(yùn)行的反硝化率均達(dá)到100%，并且第三階段運(yùn)行的反硝化效率達(dá)到最大，其效率為16.54 mmol/d。運(yùn)行過程中檢測(cè)到少量亞硝酸鹽，范圍為0.01～0.98 mmol，在每階段的初期少量累積，后期下降。在MAME-D系統(tǒng)中，最大反硝化效率為16.54 mmol/d，相當(dāng)于4.82 mg N/(L·d)，高于許多報(bào)導(dǎo)的MAME-D體系中的反硝化率(Houbron等[6]，Thalasso等[7]，Waki等[8]，Werner和Kayser[5])。然而，本系統(tǒng)的反硝化率低于Werner和Kayser[5]報(bào)導(dǎo)的流化床生物反應(yīng)器的反硝化率。在LBB3中也觀察到甲烷和硝酸鹽的消耗，最大反硝化率和反硝化效率分別為85.67%和9.88 mmol/d。亞硝酸鹽的積累在第二階段開始時(shí)最高(約為0.42 mmol)，然后慢慢下降到0。在不含甲烷的對(duì)照試驗(yàn)組LBB1中，由于接種劑中的有機(jī)殘?jiān)拖跛猁}的同化作用導(dǎo)致硝酸鹽濃度有少量的下降。

圖2 三階段運(yùn)行期間LBB1、LBB2和LBB3中硝酸鹽和甲烷的濃度變化Fig.2 Concentration changes of nitrate and methane in LBB1,LBB2 and LBB3 during three operation phases

與對(duì)照組LBB1相比，微氧和缺氧反應(yīng)器均表現(xiàn)出較高的甲烷氧化和反硝化活性。此外，MAME-D比HYME-D具有更高的甲烷氧化和反硝化活性。這可能是由于氧氣比硝酸鹽具有更低的氧化電位，使其能夠更快更容易地實(shí)現(xiàn)電子傳輸。

2.2 CO2對(duì)pH的影響

在實(shí)驗(yàn)中還觀察到了反硝化作用引起的pH升高和CO2調(diào)節(jié)pH的緩沖作用，結(jié)果如圖3所示。在LBB2的第二階段運(yùn)行中，當(dāng)混合氣體中的CO2濃度在600 mmol/L以下時(shí)，由于反硝化作用pH迅速上升到8。第二階段運(yùn)行到21天時(shí)，pH開始下降(從7.97到7.77)，應(yīng)該是由于硝酸鹽的消耗殆盡導(dǎo)致反硝化停止。在LBB3的第二階段運(yùn)行中，由于反硝化作用持續(xù)到第二階段運(yùn)行結(jié)束，pH從7.38一直增加到7.88?？梢?，反硝化作用與pH值變化呈明顯的負(fù)相關(guān)性。據(jù)報(bào)道，MAME-D和HYME-D的最佳pH值為7～8(He等[15]，Sun等[16])。因此，持續(xù)的反硝化作用可能導(dǎo)致pH超出最佳反應(yīng)pH范圍。CO2是垃圾填埋場(chǎng)厭氧發(fā)酵的天然產(chǎn)物，占準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)沼氣成分的19%～28%(Huang等[5])。因此，二氧化碳可以是一個(gè)重要的反硝化pH緩沖物。從第三階段運(yùn)行可以看出，當(dāng)CO2的濃度從250 mmol/L提高到1 297.31 mmol/L(LBB2)和從590 mmol/L提高到1 552.69 mmol/L(LBB3)時(shí)，pH出現(xiàn)明顯下降，在LBB2中從7.77下降到7.21，在LBB3中從7.88下降到6.91。在第三階段運(yùn)行中，雖然LBB2和LBB3的pH值仍有明顯的上升，但在后期穩(wěn)定在7.6和7.4的水平，說明CO2有很好的緩沖作用。

圖3 LBB2和LBB3中第二和第三階段的pH、硝酸鹽濃度和二氧化碳濃度變化Fig.3 Changes of pH,nitrate and CO2 concentrations in LBB2 and LBB3 during the second and third stages

2.3 MAME-D和HYME-D的群落多樣性和功能微生物

從LBB1、LBB2和LBB3的富集培養(yǎng)物中提取全基因組DNA，構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)。圖4系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了豐度較高的前28個(gè)菌株。由圖4可知，大多數(shù)菌株種類屬于變形桿菌門。γ-變形桿菌門中的甲基雙球菌科(Methylococcaceae)和β-變形桿菌門中的Methylophilaceae在科水平上分別在LBB2和LBB3中占優(yōu)勢(shì)。此外，Methylophilaceae中的甲基菌屬(Methylobacillus)在LBB2和LBB3的末期分別占有1 646和11 051個(gè)OTUs，相對(duì)豐度分別為6.3%和10.05%。甲基桿菌屬(Methylobacter)屬于甲基雙球菌科(Methylococcaceae)，OTUs分別為1 172和8 475，在LBB2和LBB3中分別占末期相對(duì)豐度的4.11%和7.55%。甲基單胞菌(Methylomonas)在甲基雙球菌科(Methylococcaceae)中，共有1 250和8 747個(gè)OTUs，最終分別占LBB2和LBB3中相對(duì)豐度的4.78%和8.0%。這三種細(xì)菌在兩種體系中均顯著富集，在LBB3中更為豐富。

圖4 富集培養(yǎng)樣品的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.4 Phylogenetic relationships of enrichment culture samples

Wei等[17]報(bào)道甲基桿菌屬是低氧(O25%～20%)環(huán)境中最重要的甲烷氧化菌之一。甲基單胞菌還具有將甲烷好氧氧化或缺氧氧化成有機(jī)化合物的重要潛力(Ogiso等[18])。甲烷氧化產(chǎn)生的主要有機(jī)中間體有甲醇、乙酸鹽(Costa等[19])、檸檬酸鹽和蛋白質(zhì)(Eisentraeger等[20])。據(jù)報(bào)道，甲基菌屬可以利用甲基營(yíng)養(yǎng)物的甲醇基和甲胺基作為碳源來進(jìn)行硝酸鹽反硝化作用(Doronina等[21])。因此，可以確定甲基桿菌、甲基單胞菌和甲基菌屬的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)微氧環(huán)境下的甲烷氧化耦合反硝化。此外，有多項(xiàng)研究報(bào)導(dǎo)，在甲烷和硝酸鹽充足的情況下，甲基單胞菌在好氧和厭氧環(huán)境的界面處(IMAN)豐富而活躍，這與在LBB3中觀察到的現(xiàn)象一致。它們?cè)谌毖鯒l件下豐富的原因可能是甲烷發(fā)生了發(fā)酵，為甲烷氧化菌的生存提供了能量。甲烷發(fā)酵產(chǎn)生的中間體比甲烷氧化產(chǎn)生的中間有機(jī)物更加豐富(Kalyuzhnaya等[13])。因此，大量的電子供體被運(yùn)送到甲基營(yíng)養(yǎng)性反硝化菌(如甲基菌屬)，從而發(fā)生反硝化作用。這也可以解釋為什么甲基菌屬在LBB3中的相對(duì)豐度高于LBB2。

2.4 準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)碳氮共循環(huán)系統(tǒng)假設(shè)

研究結(jié)果表明，氣體擴(kuò)散、液體滲濾、反硝化和甲烷氧化之間存在相關(guān)性，這在準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)具有很好的適用性，詳見圖5。這些過程還可能與氨氧化、硝化、有機(jī)降解和厭氧消化有關(guān)。

圖5 準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)氮碳共循環(huán)系統(tǒng)假設(shè)Fig.5 Hypothesis of nitrogen and carbon co-cycling system in semi-aerobic landfills

由圖5可以看出，在準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)中，空氣被動(dòng)擴(kuò)散到滲濾液排水系統(tǒng)，導(dǎo)致COD下降，氨氮被硝化。因此，低COD負(fù)荷和高硝酸鹽濃度的再循環(huán)滲濾液滲透到上部好氧區(qū)。在這一領(lǐng)域，有機(jī)殘留物可以進(jìn)一步降解，但高氧濃度抑制反硝化菌的活性。因此，硝態(tài)氮不能在表層土壤中被反硝化。

在中微好氧層中，LBB2中發(fā)現(xiàn)的甲基單胞菌和甲基桿菌屬等細(xì)菌在5%的氧條件下將甲烷氧化為有機(jī)化合物。隨后，本研究鑒定的甲基桿菌將硝酸鹽和有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為CO2、N2和OH-。在IMAN層中，厭氧層中產(chǎn)生的甲烷和殘留的硝酸鹽可以通過甲基單胞菌甲烷發(fā)酵和甲基菌屬還原硝酸鹽發(fā)生HYME-D。這兩個(gè)過程都會(huì)產(chǎn)生二氧化碳和OH-，它們同時(shí)起緩沖作用，維持系統(tǒng)的中性條件。

3 結(jié)論

采用MAME-D和HYME-D系統(tǒng)在浸出床生物反應(yīng)器中進(jìn)行了脫氮、甲烷氧化的實(shí)驗(yàn)研究，得出以下結(jié)論：

(1)與HYME-D工藝相比，MAME-D工藝具有更高的反硝化效率和甲烷氧化效率；

(2)注入體系的CO2作為良好的緩沖液維持pH的穩(wěn)定；

(3)細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了甲基桿菌屬和甲基單胞菌分別在微氧和缺氧條件下的甲烷氧化和甲烷發(fā)酵功能。同時(shí)，甲基菌屬消耗中間有機(jī)物并完成反硝化；

(4)基于上述結(jié)論，在準(zhǔn)好氧垃圾填埋場(chǎng)中提出了一種基于MAME-D和HYME-D的新型氮碳循環(huán)系統(tǒng)：在準(zhǔn)好氧填埋場(chǎng)微好氧層中，甲烷氧化的有機(jī)物供給反硝化菌碳源發(fā)生反硝化作用；在缺氧層，甲烷通過甲基單胞菌發(fā)生甲烷發(fā)酵作用，并和甲基菌屬作用進(jìn)行反硝化。