樊 艷
(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)
腐乳是我國(guó)的傳統(tǒng)豆制品之一,由微生物發(fā)酵制得,一直以來(lái)以其獨(dú)特的風(fēng)味和醇厚的口感廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)。其釀造史至今已有1000 多年[1],產(chǎn)地分布廣泛,種類(lèi)繁多,按其色澤分有紅腐乳、白腐乳、青腐乳等。雖然各地釀制的豆腐乳品種多樣,但其釀造工藝流程基本無(wú)差別,主要由制霉胚、腌制、加調(diào)料、裝壇、密封、發(fā)酵等6 個(gè)步驟組成[1],不過(guò)因其所用配料不同,故產(chǎn)品之間風(fēng)味各異。
近年來(lái),學(xué)者對(duì)腐乳的研究主要集中在菌種[2]、營(yíng)養(yǎng)成分[3]和風(fēng)味物質(zhì)這幾個(gè)方面。腐乳發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程[4-5],Wei 等[6]的研究結(jié)果表明油腐乳的風(fēng)味物質(zhì)形成的主要途徑有分解代謝和外源遷移,在腐乳發(fā)酵期間蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)在酶解作用下經(jīng)微生物分解代謝轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì),腐乳生產(chǎn)過(guò)程加入的辣椒、花椒和鹽等輔料中的化合物會(huì)在后發(fā)酵階段遷移至腐乳胚中,進(jìn)一步參與發(fā)酵產(chǎn)生某些風(fēng)味物質(zhì),大部分的揮發(fā)性物質(zhì)具有獨(dú)特的香氣,這些物質(zhì)共同賦予了腐乳獨(dú)特的風(fēng)味和滋味。胡文康等[7]比較分析了3 種不同類(lèi)型腐乳中揮發(fā)性成分,結(jié)果表明用頂空固相微萃取提取揮發(fā)性成分可鑒定出102 種物質(zhì),紅方腐乳含量較高的風(fēng)味物質(zhì)有11 種,白方和青方腐乳的特征風(fēng)味物質(zhì)之一分別是茴香腦和吲哚;王倫興等[8]利用SPME-GCMS 聯(lián)用技術(shù)分析了茶香腐乳和紅腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),共檢測(cè)出104 種化合物,茶香腐乳所檢出的風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量比紅腐乳多6 種;蔣麗婷等[9]采HSSPME/GC-MS 分別對(duì)白腐乳的湯汁和腐乳塊進(jìn)行測(cè)定,得到的結(jié)論是腐乳塊中揮發(fā)性成分的檢出量和檢出率均大于湯汁;Xiao 等[10]采用GC-O/AEDA 和ROAV 評(píng)價(jià)各風(fēng)味物質(zhì)對(duì)腐乳總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度,結(jié)果表明丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、反-2,4-癸二烯醛和2,6-二甲基吡嗪為腐乳的特征風(fēng)味物質(zhì)。
風(fēng)味是評(píng)價(jià)加工產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[11]。在各種食品中鑒定出的所有揮發(fā)性化合物中僅有一小部分是食品總體風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者,大部分沒(méi)有顯著影響,而這些對(duì)食品風(fēng)味有關(guān)鍵作用的化合物被定義為該食品的主體風(fēng)味物質(zhì)或關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[12]。ROAV 法是確定食品主體風(fēng)味物質(zhì)的一種新方法[12],目前用ROAV 法確定腐乳關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究還很少。鑒于傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品之一的腐乳,其家庭作坊式發(fā)酵工藝仍然有一定市場(chǎng),本文選用2 種自制腐乳和2 種市購(gòu)腐乳為原料,采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì),計(jì)算ROAV 值找到關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),分析比較兩者的異同點(diǎn),探討家庭作坊制作的腐乳其風(fēng)味組成和主要風(fēng)味物質(zhì),旨在為研究腐乳的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的機(jī)理和控制及優(yōu)化腐乳的生產(chǎn)加工提供理論支撐。
用于自制腐乳的豆腐 本地某菜場(chǎng),兩種腐乳的編號(hào)分別為M1、M2;毛霉菌菌粉 濟(jì)寧玉園生物科技有限公司;腐乳 本地某超市,為兩種不同品牌的紅方腐乳,編號(hào)分別為C1 和C2。
Avanti J-26 臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;含SPME 裝置的多功能樣品處理平臺(tái) 德國(guó)Gerstel 公司;SPME 萃取頭(50/30um DVB/CAR/PDMS)美國(guó)Supelco 公司;7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent 公司。
1.2.1 腐乳樣品的制作 參考杭梅等[13]的制作方法,稍作修改,將豆腐切成4 cm×4 cm×1.5 cm 大小,上鍋蒸5 min 后放置涼透。稱(chēng)取15 g 毛霉菌菌粉,加入500 mL 水,攪拌均勻,切好的豆腐塊間隔(約1 cm)擺放在蒸鍋上,將配好的菌懸液均勻噴灑至豆腐塊的各表面,鍋底加水,蓋好蓋子,在室溫20 ℃條件下,1 d開(kāi)始長(zhǎng)毛,發(fā)酵3 d 后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。稱(chēng)取1 000 g 毛豆腐,風(fēng)干去除水滴,蘸上40 g 的52度白酒,裹上50 g 鹽、15 g 辣椒粉和1.6 g 花椒粉[1],入瓶,M1 樣品添加10 mL 食用油封面,M2 未用油封面,于陰涼處避光密封儲(chǔ)存一周即可食用。
1.2.2 風(fēng)味物質(zhì)的分離 SPME 設(shè)置:精確稱(chēng)取3 g樣品加入20 mL 頂空瓶中,多功能樣品處理平臺(tái)保溫箱溫度是60 ℃,平衡時(shí)間10 min,萃取時(shí)間30 min,250 ℃下解析時(shí)間300 s,并設(shè)定每次進(jìn)樣前老化萃取頭的程序,老化溫度260 ℃,老化時(shí)間30 min(初次老化時(shí)間120 min)[14]。
GC-MS 條件:參考崔曉紅等[15]的方法,選用DB-5 MS 毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm);載氣He(純度≥99.999%);載氣流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;不分流進(jìn)樣;程序升溫:起始溫度35 ℃,保持5 min,以3 ℃/min 升到80 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min 升到200 ℃,保持20 min。傳輸線(xiàn)溫度是280 ℃,離子源是EI,離子源溫度是230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量是70 eV,數(shù)據(jù)采集模式為全掃描(Scan),質(zhì)量掃描范圍m/z 30~450 amu。
1.2.3 風(fēng)味物質(zhì)的鑒定 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量:氣質(zhì)聯(lián)用得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)與NIST08.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索鑒定,將匹配度大于90 的作為定性依據(jù)之一,將計(jì)算得到保留指數(shù)(retention index,RI)值與其他文獻(xiàn)測(cè)定的RI 值進(jìn)行對(duì)比確認(rèn),進(jìn)一步對(duì)腐乳的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性[16];采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量,計(jì)算得到各風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量。
RI 值的測(cè)定:取正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C7~C40),濃度為500 mg/L,稀釋100 倍,進(jìn)樣量1 μL,分流比10:1,溶劑延遲時(shí)間5 min,其余參數(shù)同上。計(jì)算公式[17]為
式中,tx是待測(cè)組分的保留時(shí)間,min;tn是碳原子數(shù)為n 的正烷烴(tn<tx)的保留時(shí)間,min;tn+1是碳原子為n+1 的正烷烴(tx<tn+1)的保留時(shí)間,min。
主體風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法:主體風(fēng)味物質(zhì)采用ROAV 法評(píng)價(jià)各揮發(fā)性成分對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn),計(jì)算公式為
式中,C%x、Tx是各揮發(fā)性成分的相對(duì)百分含量和相對(duì)應(yīng)的感覺(jué)閾值;C%stan、Tstan是對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對(duì)百分含量和相對(duì)應(yīng)的感覺(jué)閾值。
ROAV 值越大的成分對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大,1≤ROAV≤100 的成分為樣品的主體風(fēng)味化合物,0.1≤ROAV<1 的成分被認(rèn)為是對(duì)樣品總體風(fēng)味具有重要修飾作用的化合物[18]。
本文采用Excel 2007、Origin pro 2018C 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。
通過(guò)對(duì)4 種腐乳樣品揮發(fā)性物質(zhì)采用SPMEGC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè),共測(cè)出74 種揮發(fā)性化合物,腐乳樣品的總離子流色譜圖(total ion current of chromatograms,TIC)如圖1 所示,本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的參數(shù)能較好分離這些揮發(fā)性物質(zhì)。
圖1 腐乳揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current of chromatograms of flavor substances in Sufu
通過(guò)GC-MS 檢測(cè)分析,對(duì)4 種腐乳樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)(表1),結(jié)果表明4 種腐乳揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)和相對(duì)含量都有明顯差異,自制腐乳M1 和M2 中風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)較市購(gòu)腐乳C1 和C2 豐富。M1 共鑒定出36 種揮發(fā)性物質(zhì),相對(duì)含量最高的為烯烴類(lèi)物質(zhì),其中萜烯類(lèi)物質(zhì)3-蒈烯占了43.81%;M2 共鑒定出31 種揮發(fā)性物質(zhì),相對(duì)含量最高的為醚類(lèi)物質(zhì),其中茴香腦占了44.91%,是其他腐乳相對(duì)含量的2~374 倍;烴類(lèi)物質(zhì)是在M1 和M2 中被檢出揮發(fā)性物質(zhì)中種類(lèi)和含量都較高的成分。C1 和C2 共鑒定出揮發(fā)性物質(zhì)分別為27 種和14 種,二者中檢出的乙醇是相對(duì)含量最高的醇類(lèi)物質(zhì),分別為58.70%和59.45%。C1 和C2 中的酯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量較M1 和M2 檢出率高,分別為13.03%和39.93%。
表1 4 種腐乳揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 鑒定結(jié)果Table 1 Identification of aroma compounds in four kinds of fermented soybean curd by GC-MS
續(xù)表 1
根據(jù)腐乳中檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)繪制韋恩圖(圖2),可見(jiàn)4 種不同腐乳間的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)和含量區(qū)別均較大。共有的風(fēng)味物質(zhì)只有茴香腦1 種;M1、C1 和C2 共有風(fēng)味物質(zhì)有2 種,分別是癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯;C1 和C2 共有風(fēng)味物質(zhì)有5 種,分別是乙醇、月桂酸乙酯、亞油酸甲酯、9-十八酸乙酯和油酸乙酯;M1 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有3 種,分別是苯乙醇、1,2,3,4,4a,5,6,8a-十八氫-7-甲基-4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-萘和2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯;M2 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有2 種,分別是(-)-α-蒎烯和(S)-β-沒(méi)藥烯;M1、M2 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有6 種,分別是(1S,8aR)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘、(1S-順式)-1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘、β-石竹烯、α-木烏龍烯、正十五烷和正十七烷;M1 和M2 共有風(fēng)味物質(zhì)有8 種,分別是4-異丙基甲苯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環(huán)己二烯、3-蒈烯、(4aS-順式)-2,4a,5,6,7,8,9,9a-八氫-3,5,5-三甲基-9-亞甲基-1-苯并環(huán)庚烯、順式-(-)-2,4a,5,6,9a-六氫-3,5,5,9-四甲基(1H)苯并環(huán)庚烯、(R)-β-雪松烯、正十四烷和正十六烷。
風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量的高低并不能說(shuō)明其對(duì)樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度,還需結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的閾值進(jìn)行評(píng)價(jià),不同化合物的閾值不同,一些風(fēng)味物質(zhì)雖然相對(duì)含量很低,但由于其閾值低,對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)也很大[20],當(dāng)其相對(duì)含量一定時(shí),閾值越低的化合物越容易被嗅覺(jué)器官感知[21]。通過(guò)查閱書(shū)籍及相關(guān)文獻(xiàn)中已報(bào)道的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香味閾值,共找到25 種揮發(fā)性物質(zhì)的氣味閾值(表2)。因此,本實(shí)驗(yàn)只對(duì)查到閾值的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。茴香腦是M1 和M2 中相對(duì)含量最高且閾值較低的風(fēng)味物質(zhì),對(duì)這兩個(gè)樣品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大,因此定義茴香腦為M1 和M2 的主體風(fēng)味物質(zhì)(Tstan=100);乙醇是C1 和C2 中相對(duì)含量最高的物質(zhì),但閾值較高,所以定義相對(duì)含量較高且閾值較低的茴香腦和棕櫚酸乙酯分別為C1 和C2 中風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)(Tstan=100)。
按1.2.3 計(jì)算ROAV 值,結(jié)果見(jiàn)表2,乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-(2-丙烯基)苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯是4 種腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì),大部分為酯類(lèi),這和Chung[28]的研究結(jié)果一致。對(duì)腐乳的整體風(fēng)味有重要修飾作用的風(fēng)味物質(zhì)分別為苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基亞乙基)環(huán)己烯、對(duì)傘花烴、草蒿腦、二氫獼猴桃內(nèi)酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯。
醇類(lèi)物質(zhì)大多具有令人愉快的氣味[29],C1 和C2中檢測(cè)出的乙醇含量較高,酒香明顯,這與蔣芳芳[30]的研究結(jié)果一致,是C2 的主體風(fēng)味物質(zhì),而M1 和M2 中的醇類(lèi)物質(zhì)檢出量低,這可能是由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種自制腐乳(湯汁較少)的采樣多為腐乳固形物。M1 和C1 中檢測(cè)出的苯乙醇是由蛋白質(zhì)水解成的苯丙氨酸在酶解作用下代謝生成的,賦予了腐乳花甜香味,對(duì)M1 的整體風(fēng)味有一定的修飾作用。
芳香族物質(zhì)中的苯酚在白腐乳中也有報(bào)道[28],可以防腐、殺菌,能夠延長(zhǎng)腐乳的保質(zhì)期,可能來(lái)源于酪氨酸的分解[31],也可能是腐乳發(fā)酵過(guò)程中由木質(zhì)素配糖體降解生成的[32],賦予了M1 甜香味,是其主體風(fēng)味物質(zhì);對(duì)傘花烴對(duì)M1 的整體風(fēng)味有重要修飾作用。2-甲氧基-3-(2-丙烯基)苯酚是C1 的主體風(fēng)味物質(zhì),賦予了其堅(jiān)果香味。
烴類(lèi)物質(zhì)(萜烯類(lèi)化合物除外)的產(chǎn)生可能和脂肪的分解有關(guān)[33],本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的烴類(lèi)物質(zhì)包含長(zhǎng)鏈烷烴和烯烴,烷烴類(lèi)物質(zhì)由于其分子量大,且氣味閾值較高[34],香氣特征一般不顯著,所以對(duì)腐乳的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大,Shahidi 等[35]認(rèn)為飽和烴和不飽和烴在食品風(fēng)味形成過(guò)程中發(fā)揮的作用均不大,故此處不展開(kāi)分析,而烯烴類(lèi)物質(zhì)中的萜烯類(lèi)化合物閾值較低,具有花香、果香味,對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,M1 和M2 中萜烯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)豐富且相對(duì)含量較高,其中3-蒈烯多用于食用香精的配方[36],可能與加入的香辛料有關(guān),β-石竹烯是合成香料的原料,在M1、M2 和C1 中的ROAV 值均大于1,賦予了其辛香、木香味,是主體風(fēng)味物質(zhì);(S)-β-沒(méi)藥烯具有木香、柑橘香、花香、果香、青香。
醚類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自于香辛料,具有強(qiáng)烈而愉快的香氣[37]。茴香腦是4 種腐乳種共同檢出的醚類(lèi)物質(zhì),且相對(duì)含量較高且氣味閾值低,具有茴香、辛香料、甘草氣味。這與胡文康等[7]的研究結(jié)果一致;草蒿腦對(duì)M2 的整體風(fēng)味有重要的修飾作用;間苯二甲醚賦予了M2 甜香、藥香、果香和啤酒香香氣。
酯類(lèi)物質(zhì)中多數(shù)小分子量的酯類(lèi)化合物氣味閾值低,具有獨(dú)特氣味,對(duì)腐乳的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大,脂肪酸酯類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生與腐乳發(fā)酵過(guò)程中醇和脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)有關(guān)[7,38-39]。分子量較大的酯類(lèi)化合物閾值較高,但它們?cè)诟橹械臐舛雀哂谛》肿恿康孽ヮ?lèi),所以對(duì)腐乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)很大。本實(shí)驗(yàn)中檢出的乙酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)較多,且含量也較高,其中3-苯丙酸乙酯和水楊酸甲酯在M1 中的ROAV 值較大,分別賦予了樣品花香、果香和草藥香味[22];棕櫚酸乙酯賦予了C1 奶油和酯香味;油酸乙酯賦予了C2 可可香味。
進(jìn)一步比較這4 種腐乳主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的異同,本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)腐乳揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見(jiàn)表3,根據(jù)特征值大于1 的原則[36],共提取到2 個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)98.59%。
表3 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of the principal components
風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖如圖3 所示,市購(gòu)腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),如乙醇和棕櫚酸乙酯,與主成分2 呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān),而自制腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),如茴香腦、γ-壬內(nèi)酯、3-苯丙酸甲酯、水楊酸甲酯和β-石竹烯,與主成分2 呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān),表明這兩類(lèi)腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì)的組成及相對(duì)含量有差異性,這可能與腐乳所使用的的原輔料及加工工藝有關(guān)。結(jié)合圖3 可知,乙醇是C1 和C2 整體風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì);茴香腦是M1 和M2 整體風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。
圖3 主體風(fēng)味物質(zhì)的主成分載荷圖Fig.3 Principal component analysis loading plot of the key flavor compounds
本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS 技術(shù),從4 種腐乳中共檢測(cè)出74 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包含醇類(lèi)、芳香族類(lèi)、烯烴類(lèi)、烷烴類(lèi)、醚類(lèi)、酯類(lèi)和酮類(lèi)化合物等;結(jié)合ROAV 探討4 種腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì),分別是乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-(2-丙烯基)苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯這;借助主成分分析知道茴香腦是M1 和M2 最主要的風(fēng)味物質(zhì),乙醇是C1 和C2 最主要的風(fēng)味物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自制腐乳和市購(gòu)腐乳在主體風(fēng)味物質(zhì)及其相對(duì)含量上存在差異性,這可能與所用原輔料和加工工藝不同有關(guān)。研究結(jié)果將為腐乳特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理的研究以及生產(chǎn)加工提供理論支撐。本研究由于實(shí)驗(yàn)條件所限,未能采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),今后可在樣品的前處理和檢測(cè)方法的多樣性上展開(kāi)研究。