張婷婷，丁婼微，張賓樂(lè)

（1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建南平 354300；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361012；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122）

香菇在民間素有“山珍”之稱(chēng)，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，味道鮮美，享有“植物皇后”美譽(yù)。其子實(shí)體含有豐富的天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸及一般食品中罕見(jiàn)的傘菌氨酸、口蘑酸及鵝氨酸等呈味氨基酸，還富含鳥(niǎo)苷酸、腺苷酸、胞苷酸、尿苷酸等呈味核苷酸。香菇中的5'-核苷酸對(duì)咸、酸、苦、腥味等具有消殺作用，其中5'-鳥(niǎo)苷酸添加到鮮味劑氨基酸類(lèi)物質(zhì)中可使鮮度提高幾十倍至上百倍，是著名的強(qiáng)力助鮮劑。香菇中含有的葡萄糖、果糖、半乳糖等碳水化合物、不飽和脂肪酸、VB1、VB2、VPP及Fe、Ca 等微量元素，與呈鮮味物質(zhì)相互作用，形成香菇獨(dú)特的鮮美滋味。此外，還含有多糖、香菇腺嘌呤、維生素D 等生物活性物質(zhì)，賦予了香菇的藥用價(jià)值[1-5]。

食用菌具有味道鮮美、提高免疫力與保健功效等多種特點(diǎn)，在復(fù)合調(diào)味品中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[6]。香菇調(diào)味品的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了我國(guó)調(diào)味料領(lǐng)域在動(dòng)植物蛋白水解物和復(fù)合調(diào)味料研究中的一個(gè)空缺[7]。將香菇經(jīng)過(guò)酶解，使組織結(jié)構(gòu)破壞，香菇中的風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分溶出，再經(jīng)適當(dāng)加工處理，可制成香菇調(diào)味品基料[8-11]。目前提取香菇的方法包括熱水浸提、酶解提取、自溶提取、微波提取、超聲提取等，其中應(yīng)用最廣泛的是酶解法。相比于單一酶法提取，復(fù)合酶法具有提取率高，時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[12]。本研究以香菇為原料，氨基酸態(tài)氮含量及感官評(píng)分為考察指標(biāo)，首先采用纖維素酶降，使香菇細(xì)胞壁破碎，有利于胞內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子的溶出；再利用復(fù)合蛋白酶降解，增加小分子肽和游離氨基酸等呈味物質(zhì)的溶出，提高香菇酶解液的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。以提高香菇附加值、豐富調(diào)味品市場(chǎng)及提高調(diào)味料的天然、營(yíng)養(yǎng)及安全性為目的，為香菇系列調(diào)味品的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

鮮香菇 雙好超市；纖維素酶（酶活力5 萬(wàn)U/g） 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；風(fēng)味蛋白酶（酶活力10 萬(wàn)U/g）浙江一諾生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活力5 萬(wàn)U/g）南寧龐博生物工程有限公司。氫氧化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)實(shí)劑有限公司；乙酸鋅、亞鐵氯化鉀 上海展云化工有限公司；濃硫酸、濃鹽酸 三圓化學(xué)實(shí)劑有限公司；甲醛、酒石酸鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸 上海國(guó)藥實(shí)劑集團(tuán)。

JYL-C022E 榨汁機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；YL-100 實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司；BAS124S 電子天平 鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋 邦西儀器科技（上海）有限公司；C21-Simple103 電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；TG-16G 高速離心機(jī) 億發(fā)科技有限公司；UV752 分光光度儀 天泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CJJ78-1 磁力攪拌器 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng)；PHS-25 酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 將香菇制成調(diào)味品基料的工藝流程如下：

新鮮香菇→預(yù)處理→纖維素酶酶解→滅酶→測(cè)定還原糖含量→復(fù)合蛋白酶酶解→滅酶→冷凍離心→取上清液→測(cè)定氨基態(tài)氮含量、成品檢驗(yàn)

1.2.2 操作要點(diǎn) 將新鮮香菇除梗、洗凈、置于榨汁機(jī)中，加入蒸餾水并打漿，制成香菇與水的質(zhì)量比為14%的香菇勻漿；選擇適宜的pH、溫度、時(shí)間及加酶量進(jìn)行水解；置于沸水浴中滅酶15 min；在7000 r/min、4 ℃條件下，冷凍離心15 min。

1.2.3 纖維素酶添加量的確定 該廠(chǎng)家提供的纖維素酶，最適酶解溫度為50 ℃，pH 為4.8。因此，取30 mL 香菇勻漿，在最適條件下，分別添加0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%和2.0%的纖維素酶水解3 h，在100 ℃水浴中滅酶15 min，再冷凍離心后取上清液，測(cè)定還原糖含量，平行測(cè)定三組。

1.2.4 復(fù)合蛋白酶酶解的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取40 mL纖維素酶降解后的香菇液進(jìn)行復(fù)合蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)。資料表明[14]風(fēng)味蛋白酶與菠蘿蛋白酶復(fù)合酶解的香菇液風(fēng)味最好，水解程度較高；同時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)得出復(fù)合蛋白酶的不同復(fù)配比例對(duì)酶解效果影響不大，故選取風(fēng)味蛋白酶與菠蘿蛋白酶以酶活比1:1 復(fù)配進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

固定總加酶量0.4%，pH 為6.5，酶解時(shí)間3 h，溫度分別設(shè)為40、45、50、55 和60 ℃，考察酶解溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，總加酶量0.4%，pH 分別設(shè)為6、6.5、7、7.5 和8，考察pH 對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，pH 為6.5，總加酶量0.4%，分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5 和3 h，考察酶解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，pH 為6.5，總加酶量分別設(shè)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%，考察總加酶量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.2.5 復(fù)合酶酶解的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用DesignExpert 10 設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以pH、酶解溫度、總加酶量為因子，氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素水平實(shí)驗(yàn)方案，如表1 所示。平行測(cè)定三組實(shí)驗(yàn)，得出復(fù)合酶解的最適工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface factor level design

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.6.1 還原糖的測(cè)定 采用DNS 比色法[15]。

1.2.6.2 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 參照GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的第一法[16]。

1.2.6.3 感官評(píng)定 取最優(yōu)工藝參數(shù)下制備的香菇調(diào)味基料40 mL，置于透明的塑料杯中。挑選10 名食品專(zhuān)業(yè)的教師，組建感官評(píng)定小組，根據(jù)表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定，總分百分制。

表2 香菇調(diào)味基料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for Lentinus edodes flavoring substrates

1.2.6.4 谷氨酸鈉的測(cè)定 對(duì)酶解前的香菇勻漿及酶解后的香菇調(diào)味基料中的谷氨酸鈉含量，參照SB/T10371-2003《中華人民共和國(guó)商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)雞精調(diào)味料》中的甲醛值法[17]進(jìn)行對(duì)比測(cè)定。

1.2.6.5 呈味核苷酸二鈉的測(cè)定 對(duì)酶解前的香菇勻漿及酶解后的香菇調(diào)味基料，參照SB/T10371-2003 中的5.2.4 部分[17]進(jìn)行呈味核苷酸二鈉含量的對(duì)比測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次，采用SPASS 18 對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，響應(yīng)面優(yōu)化采用Design-Expert 10 軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量的確定

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 設(shè)540 nm 處測(cè)得的吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)樣的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1 所示，其決定系數(shù)R2為0.9993，線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Glucosestandard curve

2.1.2 纖維素酶添加量的確定 由于香菇的子實(shí)體本身的酶活力較低，難以有效作用使菌絲體自溶。因而在抽提細(xì)胞內(nèi)水溶性呈味物質(zhì)時(shí)，必須外加相應(yīng)的酶類(lèi)。纖維素酶可將纖維素部分降解為葡萄糖并有破壞菇體細(xì)胞壁的作用，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、多糖等物質(zhì)的溶出。因此。外加纖維素酶可明顯提高香菇固形溶出率和蛋白溶出率，對(duì)蛋白水解也有一定的促進(jìn)作用[4,18]。

如圖2 所示，隨著纖維素酶添加量的增加，還原糖含量逐漸上升。添加量在0.2%～1%時(shí)，還原糖含量上升較為緩慢；在1%～1.4%時(shí)，還原糖含量迅速上升；添加量大于1.4%，還原糖含量雖有上升，但上升速率減緩。這是由于纖維素酶濃度超過(guò)底物濃度時(shí)，再添加酶對(duì)酶解反應(yīng)影響不大。因此綜合成本因素考慮，纖維素酶添加量確定在1.4%為宜。

圖2 加酶量對(duì)還原糖含量的影響Fig.2 Effect of adding enzyme amount on reducing sugar content

2.2 復(fù)合酶解條件的確定

復(fù)合蛋白酶可將菌體蛋白和溶出的胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解為一些水溶性的小分子含氮物質(zhì)，提高固形物溶出率和呈鮮味氨基酸的含量[4]。不同因素條件對(duì)香菇液酶解效果的影響如下。

2.2.1 酶解溫度的確定 由圖3 可知，隨著溫度的上升，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)(P＜0.05)，在50 ℃時(shí)最高，這是由于酶在最適溫度范圍內(nèi)，能表現(xiàn)出最高的酶活性。在50 ℃之后，氨基酸態(tài)氮的含量開(kāi)始下降，這是由于溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶的變性失活。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中酶解溫度設(shè)定在50 ℃左右。

圖3 酶解溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on amino nitrogen content

2.2.2 酶解pH 的確定 由圖4 可知，pH 對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響較為顯著（P＜0.05）。隨著pH 的增大，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH 為6.5 時(shí)達(dá)到最高。由于不同的酶在各自的最適pH 范圍內(nèi)，能達(dá)到最高的酶活力，水解效果最好。因此，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中復(fù)合酶解的pH 設(shè)定在6.5 左右。

圖4 酶解pH 對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on amino nitrogen content

2.2.3 酶解時(shí)間的確定 由圖5 可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。在2.5 h 前，上升速率較大（P＜0.05），2.5 h 之后趨于平緩（P＞0.05），說(shuō)明酶解反應(yīng)已接近結(jié)束。因此，從成本因素考慮，酶解時(shí)間可直接確定在2.5 h。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on amino nitrogen content

2.2.4 總加酶量的確定 由圖6 可知，隨著加酶量的增大，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。在加酶量0.4%前，上升速率較為顯著（P＜0.05）；在0.4%后，上升趨于平緩（P＞0.05），說(shuō)明加酶量已飽和或超過(guò)底物量，再過(guò)多添加酶對(duì)酶解反應(yīng)并無(wú)促進(jìn)作用。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)中總加酶量設(shè)定在0.4%左右。

圖6 總加酶量對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of total amount of enzyme added on amino nitrogen content

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了pH (A)、酶解溫度（B）、總加酶量（C）的二次多元回歸方程：Y=0.061+3.375×10-3A-0.014B-3.000×10-3C-3.250×10-3AB-6.500×10-3AC+3.000×10-3BC-0.010A2-3.575×10-3B2-0.017C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Response surface experiment scheme and results

由表4 方差分析可知，得到該模型中的F值為91.43，且P值小于0.01，而失擬項(xiàng)不顯著P=0.7714＞0.05，表明模型顯著，二次模型選擇合適。該模型R2=0.9916，表明該模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，適合對(duì)香菇酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

各單項(xiàng)因素A、B、C 影響氨基酸態(tài)氮含量均為極顯著（P＜0.01）；pH(A)和酶解溫度（B）的交叉項(xiàng)以及酶解溫度（B）和總加酶量（C）的交叉項(xiàng)對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響具有顯著性（P＜0.05），pH（A）和總加酶量（C）的交叉項(xiàng)對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明氨基酸態(tài)氮含量對(duì)該模型具有高度顯著性。因此，該模型的回歸方程可代替實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值來(lái)預(yù)測(cè)和分析結(jié)果。根據(jù)回歸分析的結(jié)果與回歸方程做出因素影響的響應(yīng)面和等高圖如圖7、圖8和圖9 所示。

圖7 酶解溫度與pH 對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響的響應(yīng)面和等高圖Fig.7 Response surface and contour map of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and pH on amino nitrogen content

圖8 酶解溫度與總加酶量對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響的響應(yīng)面和等高圖Fig.8 Response surface and contour map of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and total amount of enzyme added on amino nitrogen content

圖9 酶解pH 與總加酶量對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響的響應(yīng)面和等高圖Fig.9 Response surface and contour map of the effects of enzymatic pH and total amount of enzyme added on amino nitrogen content

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面模型擬合方程得出的最佳工藝參數(shù)如下：pH 為6.8，溫度48.7 ℃，總加酶量0.28%，氨基酸態(tài)氮含量的預(yù)測(cè)值為0.61 mg/mL。以該工藝參數(shù)進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，氨基酸態(tài)氮含量實(shí)測(cè)值為0.63±0.01 mg/mL，與模型的預(yù)測(cè)值0.61 mg/mL 相對(duì)誤差僅為3.28%，證明了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.4 成品檢驗(yàn)

2.4.1 感官評(píng)定 以最優(yōu)工藝參數(shù)制得的香菇調(diào)味基料成品，色澤呈棕褐色、明亮無(wú)沉淀物，味感醇厚鮮美，有香菇特有的風(fēng)味，微苦。感官評(píng)定總分為95 分。

2.4.2 酶解前后谷氨酸鈉含量的變化 香菇的主要呈鮮味物質(zhì)為5’-核苷酸和呈鮮味氨基酸[19]。由圖10可知，經(jīng)酶解后的香菇液，其谷氨酸鈉的含量從酶解前的0.306%升高至酶解后的0.765%，提高了約1.5 倍。谷氨酸鈉作為香菇的主要呈鮮物質(zhì)之一，為酶解后的香菇液提供了香菇的特有風(fēng)味，酶解后鮮味顯著提升。

圖10 酶解前后谷氨酸鈉含量的變化Fig.10 Change in the content of monosodium glutamatebefore and after enzymatic hydrolysis

2.4.3 復(fù)合酶酶解前后的呈味核苷酸二鈉含量對(duì)比

呈味核苷酸二鈉主要在香菇菌體細(xì)胞內(nèi)存在，酶解尤其是纖維素酶破壞了香菇的細(xì)胞壁，使胞內(nèi)呈味核苷酸二鈉更易溶出[14]。

由圖11 可知，香菇液被酶解后，呈味核苷酸二鈉含量從酶解前的0.45%提高至酶解后的0.53%，提高了17.78%。

圖11 酶解前后呈味核苷酸二鈉含量的變化Fig.11 Changes in the content of taste nucleotide disodium before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論與展望

本課題以新鮮香菇為原料，采用復(fù)合酶法制備食品調(diào)味基料。將新鮮香菇勻漿先采用1.4%纖維素酶水解，再采用復(fù)合蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶:菠蘿蛋白酶=1:1）在48.7 ℃，pH6.8，總加酶量0.28%條件下水解2.5 h，制備的香菇調(diào)味基料中氨基態(tài)氮含量為0.63±0.01 mg/mL。與酶解前相比，谷氨酸鈉含量提高了約1.5 倍，呈味核苷酸二鈉含量提高了17.78%。制得的香菇調(diào)味基料呈棕褐色、質(zhì)地均一穩(wěn)定，滋味醇厚鮮美，有香菇特有風(fēng)味，微苦，感官評(píng)分較高。

本課題采用先纖維素酶降解、后菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合提取的方式，在最適宜條件下，使香菇提取液中的氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，其它小分子營(yíng)養(yǎng)成分、功能性成分及風(fēng)味物質(zhì)被充分抽提，獲得的香菇調(diào)味基料感官評(píng)分最高。與于洋[20]的研究結(jié)果相比較，得到的酶解液中氨基態(tài)氮含量接近，但降低了總加酶量、酶解時(shí)間及酶解溫度，因此明顯降低了成本。為促進(jìn)香菇的提取利用及香菇系列天然營(yíng)養(yǎng)鮮味劑的開(kāi)發(fā)，提供了理論依據(jù)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前在整個(gè)調(diào)味品市場(chǎng)當(dāng)中，復(fù)合調(diào)味品占據(jù)的市場(chǎng)份額為80%以上，但是我國(guó)的只有20%左右，可以說(shuō)有非常大的發(fā)展前景，調(diào)味品市場(chǎng)今后最具發(fā)展?jié)摿Φ氖翘烊粡?fù)合調(diào)味料[21-22]。食用菌類(lèi)調(diào)味料已逐漸被消費(fèi)者喜愛(ài)接受，采用酶解香菇法制備調(diào)味品具有廣闊的市場(chǎng)空間，有待繼續(xù)深入研究開(kāi)發(fā)。該提取液可進(jìn)一步脫水成粉末成品，利于貯藏；亦可調(diào)配其它鮮味原料，開(kāi)發(fā)出不同風(fēng)味系列的天然復(fù)合調(diào)味品，如復(fù)合食用菌調(diào)味汁、鮰魚(yú)香菇調(diào)味醬等[1,23-25]。