楊 悅，李 燕，王小方，汪 磊，焦路陽*

(1.河北地質(zhì)大學(xué) 數(shù)理學(xué)院,河北 石家莊050031；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,河南 新鄉(xiāng)453100)

對抗生素的過分依賴和濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥菌株,如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]、耐萬古霉素糞腸球菌(VER)[2]、NDM-1超級細(xì)菌[3]等的出現(xiàn),引起了全世界范圍的普遍擔(dān)憂,“禁抗”呼聲越來越高,研發(fā)能替代抗生素的新型抗感染產(chǎn)品成為當(dāng)務(wù)之急?？咕?antimicrobial peptides,AMPs)廣泛存在于多種生物體內(nèi),是宿主固有免疫系統(tǒng)的一類抵抗外源性病原微生物的天然免疫小分子多肽。網(wǎng)站http：//aps.unmc.edu/AP/main.php公布了3 800多種抗菌肽。天然抗菌肽通常由10～40個(gè)氨基酸殘基組成[4],具有廣譜抗菌、活性穩(wěn)定、免疫原性低,綠色無公害等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。不同生物體產(chǎn)生的抗菌肽具有特定的抗菌譜,具有一定的免疫學(xué)活力[7],可特異性抑殺細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞,對正常的真核細(xì)胞幾乎無毒性或只有低毒性,因此抗菌肽一直被視為理想的抗生素替代物。

在食品工業(yè)中,加入防腐劑可抑制致病菌的增殖,從而降低致病菌引發(fā)人類患病的風(fēng)險(xiǎn)。防腐劑(圖1)分傳統(tǒng)和天然防腐劑。傳統(tǒng)防腐劑用于食品中常常具有副作用[8],如亞硝酸鹽和硝酸鹽與白血病、結(jié)腸癌、膀胱癌和胃癌有關(guān),山梨酸鹽和山梨酸與蕁麻疹和接觸性皮炎有關(guān),苯甲酸鹽可能與過敏、哮喘和皮疹有關(guān)?？咕淖鳛樘烊环栏瘎?可以抑制致病菌的繁殖,且熱穩(wěn)定性好,安全無毒害,在食品的防腐和保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。乳鐵蛋白,蛙皮素,乳酸鏈球菌素(nisin)等已被廣泛應(yīng)用于食品的防腐和保鮮領(lǐng)域中。

圖1 傳統(tǒng)防腐劑和抗菌肽的特點(diǎn)Fig.1 Characteristics of traditional preservatives and antibacterial peptides

AMPs種類繁多,根據(jù)生物學(xué)來源分為植物來源、動物來源和微生物來源3大類[9]。植物抗菌肽于1942年首次發(fā)現(xiàn)[10],后相繼從小麥、苦參、擬南芥、馬鈴薯等分離得到,主要包括硫堇(thionins),植物防御素(defensins),脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTPs),黑芥子酶(myrosinase)結(jié)合蛋白,橡膠蛋白 (heveins)和knottins樣多肽,蛇毒、環(huán)肽以及水解物中的肽。動物抗菌肽最早是由瑞典科學(xué)家Boman等人發(fā)現(xiàn)的天蠶素(cecropins),后繼從動物體內(nèi)獲得的magainin,MSI-78,PR-39,pleurocidin以及dermaseptin S4等均具有抗菌活性。微生物抗菌肽包含nisin,polymycin和片球菌素(pediocin)等?？咕牡陌被嵝蛄泻徒Y(jié)構(gòu)具有顯著差異,其共性為：均為陽離子肽,且具有兩親性的活性結(jié)構(gòu)?？咕目煞謩e歸屬為α-螺旋、β-折疊、β-發(fā)夾、擴(kuò)展和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。Indolicidin呈現(xiàn)擴(kuò)展結(jié)構(gòu),無固定的構(gòu)象[11],LL-37在膠束(micelles)模擬膜中呈現(xiàn)典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[12]。

1 抗菌肽的制備方法

抗菌肽的生產(chǎn)成本是制約其作為臨床特效藥和新型防腐劑商業(yè)化推廣應(yīng)用的一個(gè)重要因素。天然提取和人工合成抗菌肽成本高,產(chǎn)量低,且污染環(huán)境。相比于傳統(tǒng)的天然提取和人工合成,基因工程法有著可以大規(guī)模生產(chǎn),成本低等潛在優(yōu)勢,是生產(chǎn)抗菌肽的有效方法。近些年分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)的發(fā)展也為抗菌肽的基因工程化提供了良好的技術(shù)支持[13]?；蚬こ讨苽淇咕闹饕么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng),酵母表達(dá)系統(tǒng),桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),植物表達(dá)系統(tǒng)和動物表達(dá)系統(tǒng)[14]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,大腸桿菌成本低、易培養(yǎng)、生長迅速,成為最常用的宿主細(xì)胞[15-16]。但抗菌肽具有抗菌活性,會對宿主菌產(chǎn)生殺傷作用,而且易被宿主菌的蛋白酶降解[17]。抗菌肽添加融合標(biāo)簽共表達(dá)可防止抗菌肽對宿主菌的殺傷而提高產(chǎn)量,把抗菌肽表達(dá)為包涵體可防止宿主菌的蛋白酶對抗菌肽的降解[16,18-19]。融合表達(dá)蛋白包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase,GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein,MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)、酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(amidophosphoribosyl transferase,PurF)等[17]。臭鮭蛙皮膚分泌抗菌肽ORBK在大腸桿菌中已與MBP融合蛋白共表達(dá)過,并進(jìn)行了分離純化[20]。重組抗菌肽OsTHION15可通過大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)來制備[21]。

酵母表達(dá)系統(tǒng)中,單細(xì)胞真核生物的酵母可以直接表達(dá)出有活性的抗菌肽,該抗菌肽對酵母無毒性,其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制較大腸桿菌更完備,具備對表達(dá)產(chǎn)物分泌和加工修飾能力。酵母菌主要有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),畢赤酵母(Pichia pastoris),多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)和耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)。其中釀酒酵母和畢赤酵母應(yīng)用最為廣泛。畢赤酵母可有效表達(dá)重組蛋白HD5,hBD2,羊的BD1或豬的BD2[22-24]。LL-37可通過畢赤酵母的表達(dá)系統(tǒng)制備[25]。酵母系統(tǒng)的缺點(diǎn)是在28℃的不穩(wěn)定性和在發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白水解活性太高[26]。

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中,昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)安全,易于操作,能夠高效表達(dá)大的外源基因,可對表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行修飾[27],但表達(dá)成本高,而且還需要病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以及病毒庫等[28]?？咕呐Ｈ殍F蛋白N端和C端可通過昆蟲/桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)。

植物表達(dá)系統(tǒng)中,植物因其易生長、成本低、受內(nèi)毒素和人類致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)小的特點(diǎn),具有大規(guī)模純化的潛力[32],成為有前景的抗菌肽生物工廠系統(tǒng)。植物表達(dá)系統(tǒng)制備的cecropin A能抵抗細(xì)菌和真菌病原體[32-33]。植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白,通常是整合到植物葉綠體基因組[34-37]。其制備的重組蛋白產(chǎn)量高,可高達(dá)2 kg[37]。線狀陽離子抗菌肽cecropin A可通過水稻種子制備[32],CanThio1-8可由辣椒在其花中制備[38],紫花苜宿中的OsTHION15在其種子、葉子、幼苗、根和花絮等組織器官中均有表達(dá)。

動物表達(dá)系統(tǒng)中,動物能夠促使蛋白質(zhì)正確折疊,提供翻譯后加工功能,產(chǎn)生類似于人類的天然蛋白質(zhì),成為生產(chǎn)重組肽的首選。CHO細(xì)胞系是制備蛋白質(zhì)的主要哺乳動物宿主[29]。CHO培養(yǎng)體系是大型攪拌槽生物反應(yīng)器[30]。隨著培養(yǎng)基組分的改進(jìn)和生物工藝技術(shù)的發(fā)展,其產(chǎn)量可達(dá)到1~5 g/L[31]。

2 抗菌肽的作用機(jī)制

抗菌肽的作用模式分為結(jié)合,插入及孔道形成3個(gè)步驟[39],主要有桶板模型、環(huán)孔模型和毯式模型,其中抗菌肽與細(xì)胞膜結(jié)合是抗菌肽發(fā)揮活性的必要條件。與傳統(tǒng)抗生素對細(xì)菌靶點(diǎn)或代謝通路發(fā)揮作用的方式不同,抗菌肽特異性靶向細(xì)胞膜,作用于非特異性的分子靶點(diǎn)并迅速破壞細(xì)胞膜。

原核生物和真核生物細(xì)胞膜成分不同,抗菌肽特異性破壞原核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而殺死細(xì)菌[40]。原核生物細(xì)胞膜中的磷脂主要是帶有陰離子的磷脂酰甘油,磷脂酰絲氨酸和心磷脂,且陰離子脂質(zhì)暴露于表面,而抗菌肽為陽離子多肽,它們之間發(fā)生相互作用,第一作用力是帶正電氨基酸和帶負(fù)電細(xì)胞膜之間的靜電作用,第二作用力是肽的雙親性結(jié)構(gòu)域與膜磷脂之間的疏水相互作用。如果達(dá)到抗菌肽的閾值濃度,上述的這些作用力是劇烈的,進(jìn)而達(dá)到對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞。而真核生物細(xì)胞膜中主要是兩親性磷脂,陰離子脂質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)[41],故抗菌肽對正常的真核生物細(xì)胞一般不起作用。

抗菌肽的具體抗菌方式取決于細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌結(jié)構(gòu)組分不同,故抗菌肽的作用機(jī)制也存在差異(圖2)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均含有肽聚糖。革蘭氏陽性菌的肽聚糖裸露于細(xì)胞外,數(shù)層層疊在一起和磷壁酸共同構(gòu)成細(xì)胞壁。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁則由外膜和周質(zhì)間隙組成,細(xì)胞壁除含有一層肽聚糖外還有較厚的脂類層[42]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌膜外層的主要脂質(zhì)成分?？咕脑谂c革蘭氏陽性菌作用時(shí),主要作用于革蘭氏陽性菌的磷壁酸；與革蘭氏陰性菌作用時(shí),通過解離帶負(fù)電荷的LPS膠束發(fā)揮作用。

真菌具有外殼——細(xì)胞壁。殼聚糖是細(xì)胞壁的主要組分[43]?？咕牡目拐婢鷻C(jī)制包括：與真菌細(xì)胞壁殼聚糖有效結(jié)合,干擾真菌細(xì)胞壁合成；與細(xì)胞膜中的麥角甾醇/膽固醇結(jié)合,破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；解聚肌動蛋白細(xì)胞骨架以及靶向細(xì)胞內(nèi)的線粒體細(xì)胞器[9,44]。

3 抗菌肽在食品防腐和保鮮中的應(yīng)用

抗菌肽作為天然防腐劑,安全無毒、熱穩(wěn)定性好、抗菌性強(qiáng),只對原核生物和突變細(xì)胞起作用,而對真核生物無害,因此抗菌肽在食品的防腐和保鮮中顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

羊毛硫抗生素(lantibiotics)是革蘭氏陽性菌通過核糖體合成的一類抗菌肽,具有19~38個(gè)氨基酸,常含有一些非天然氨基酸,如羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸和2-氨基異丁酸,其相對分子質(zhì)量小于5 000。它可抑制微生物特別是革蘭氏陽性菌的生長,對革蘭氏陰性菌、酵母和真菌基本無抑制作用,主要作用于細(xì)胞膜。陽離子肽nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種相對分子質(zhì)量為3 500的羊毛硫胺素抗生素,屬于A型羊毛硫抗生素的環(huán)形抗菌肽,能夠通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而殺死靶細(xì)菌,可抑制革蘭氏陽性菌的生長而對食品的感官特性沒有影響,保持食品的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味特性,已成功作為天然食品防腐劑應(yīng)用于魚類等食品防腐保鮮領(lǐng)域中[45-46],成為傳統(tǒng)防腐抗菌藥物的良好替代品(表1)。

圖2 抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的作用機(jī)制Fig.2 Interaction mechanism of AMPs to the Gram-positive and Gram-negative bacteria[39]

Nisin可抑制乳酸菌(LAB)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、熱殺索絲菌(B.thermosphacta)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(E.coli)和無害李斯特菌(L.innocua)的生長,在肉和雞蛋類食品中有良好的防腐保鮮效果。Nisin能有效防止LAB導(dǎo)致的肉醬香腸的腐敗[47]；對土耳其發(fā)酵香腸中L.monocytogenes的抑制與其濃度呈正相關(guān)[48]；聯(lián)合溶菌酶加入真空包裝豬肉中可有效抑制B.thermosphacta和LAB的生長[49-50]；與茶多酚聯(lián)用,能夠有效延長低溫肉制品的保藏期。因?yàn)棣?環(huán)糊精(β-CD)提高了nisin在胰蛋白酶中的穩(wěn)定性,推遲了nisin的降解,nisin與β-CD聯(lián)合應(yīng)用可以有效降低熟豬肉中的細(xì)菌生長[51]。Nisin與腸肽CRL35聯(lián)用,可有效控制牛肉泥中和肉類加工系統(tǒng)中的L.monocytogenes[52]。Nisin可延長雞蛋的保存期。Nisin加入巴氏殺菌液體中,可降低雞蛋中L.monocytogenes和B.cereus的數(shù)量,從而延長產(chǎn)品的冷藏貨架期[8,53-54]。Nisin和pediocin PA-1/AcH對L.monocytogenes具有拮抗作用,在熱處理下兩者具有協(xié)同作用[53,55-56],在全雞蛋和蛋清殺菌過程中增加了Salmonella enteritidis的熱敏感性[56]。Nisin聯(lián)合高壓處理全蛋液,使得E.coli和L.innocua的數(shù)量顯著降低,且這些細(xì)菌在冷藏一個(gè)月后完全變性[57]。

Nisin在米飯和面包的儲藏中也顯示了良好的效果,可抑制菌落的增加,從而延長米飯和面包的儲藏時(shí)間[58]。Nisin由于可以抑制嗜酸耐熱菌、水楊酸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和嗜熱梭菌的生長,對飲料的保鮮效果也十分明顯。在蘋果汁和葡萄汁的保鮮中,它可抑制嗜酸耐熱菌和水楊酸桿菌的生長,減緩果汁和飲料的變質(zhì)[59-61]。在豆?jié){中,它可抑制嗜熱脂肪芽孢桿菌和椰奶、椰汁中的嗜熱梭菌的增殖[62]。Nisin還可使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.acidoterrestris)內(nèi)孢子失活[59-60,63]。Nisin的防腐保鮮不影響食品的風(fēng)味、質(zhì)地和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)。但是它在高溫條件下性質(zhì)不穩(wěn)定,在60~70℃,其活性大約降低80%。它對蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶敏感,在pH非常小的范圍內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性。

Nisin可用于水果的保鮮,但對酸性環(huán)境中的水果保鮮效果不明顯。Nisin可抑制甜瓜片中L.monocytogenes的生長,和噬菌體聯(lián)用,其活性可增強(qiáng)。但它對酸奶中水果的保鮮效果不明顯[64]。Nisin還可用于白玉琵琶的保鮮,降低琵琶的腐爛率[65]。Nisin和bovicin HC5可抑制罐裝芒果果肉中C.tyrobutyricum的生長和隨后的產(chǎn)氣[66]。Nisin還可用于蔬菜的保鮮。它減少了冷藏豆芽中L.monocytogenes的數(shù)量[67]。在罐裝蔬菜中,nisin可以抑制非嗜酸桿菌 (Bacillus stearothermophilus,Clostridium the rmosaccharolyticum)和嗜酸桿菌(Clostridiumpasteurianum,Bacillusmacerans,Bacillus coagulans)導(dǎo)致的腐敗。在加工過程中,把nisin加入到巴氏殺菌和真空包裝的土豆泥中,可充分抑制細(xì)菌的生長[62]。

表1 Nisin在食品防腐與保鮮中的應(yīng)用Table 1 Applications of nisin in food antisepsis and preservation

4 展 望

抗菌肽種類繁多,來源廣泛,制備方法除了天然提取和人工合成,還可利用基因工程法中的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)和動物表達(dá)系統(tǒng)。其主要作用機(jī)制是抗菌肽和細(xì)胞膜之間發(fā)生相互作用。關(guān)于該相互作用目前多是關(guān)于兩親性的抗菌肽在脂質(zhì)體表面形成孔洞的理論研究,但是對孔洞形成機(jī)理的動力學(xué)方面,尤其在實(shí)驗(yàn)條件下關(guān)于這一動態(tài)過程的檢測與驗(yàn)證研究并未報(bào)道。抗菌肽在生物體內(nèi)廣泛存在,具有廣譜抗菌性,綠色無污染,甚至還有營養(yǎng)保健作用。它作為天然防腐和保鮮劑起到了良好的效果,因此被廣泛應(yīng)用于食品防腐和保鮮領(lǐng)域中。但其制備工藝復(fù)雜,成本較高,抑菌濃度相對較高,不利于大規(guī)模生產(chǎn),這大大限制了其商品化進(jìn)程。因此,研發(fā)抗菌肽的制備工藝,提高產(chǎn)量,降低成本,并研究其動態(tài)作用機(jī)制的細(xì)節(jié),可有效推動抗菌肽進(jìn)入食品防腐和保鮮領(lǐng)域。