劉 利， 楊 帆， 李素霞， 郭 奧， 劉 曉， 王之可

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室，上海 200237；2. 上海雅心生物技術(shù)有限公司，上海 200231）

天然大豆Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑（Soybean Bowman-Birk Trypsin Inhibitor, BBTI），是一種雙頭絲氨酸蛋白酶抑制劑，蛋白分子大小為8 kDa，空間結(jié)構(gòu)支架由7對高度保守的二硫鍵組成[1-2]，位于分子表面的兩個活性位點P1（Lys16-Ser17）和P2（Leu43-Ser44）[3]可分別抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶。有文獻報道，通過分離BBTI與胰蛋白酶、BBTI與糜蛋白酶形成的二元復(fù)合物以及BBTI與這兩種酶同時結(jié)合形成的三元復(fù)合物，驗證了BBTI有兩個不同的活性位點，而且兩個活性位點可以獨立特異性識別胰蛋白酶和糜蛋白酶[4]。

BBTI具有廣泛的應(yīng)用價值而成為研究的熱點,在轉(zhuǎn)基因煙草植物中導(dǎo)入BBTI可增加植物防御病原體和害蟲的能力[5]，在后來的研究中發(fā)現(xiàn)很多谷物種子中也存在同源性的BBTI，可以抵御害蟲對種子的傷害[6]，形成了種子重要的防御系統(tǒng)。除此之外，BBTI具有抗癌作用，飲食中攝入大量豆類的人群患前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和皮膚癌的機率更小[7]，臨床實驗發(fā)現(xiàn)BBTI可以有效治療口腔白斑患者，且使用后沒有發(fā)現(xiàn)副作用[8]。傳統(tǒng)獲得BBTI的方法是從大豆中提取，來源及生產(chǎn)成本較高，不利于BBTI的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，有研究報道通過基因工程技術(shù)可將BBTI基因進行重組表達，如BBTI在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)了異源表達，但是表達的部分BBTI會降解[9]。

在本文的研究中，使BBTI以融合蛋白的形式在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達，經(jīng)純化后獲得較高純度的重組BBTI（rBBTI）。對比研究了BBTI和rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)和抑制機理，發(fā)現(xiàn)二者的酶學(xué)性質(zhì)和抑制機理一致，抑制胰蛋白酶時為一種典型的反競爭性抑制劑，而在抑制糜蛋白酶時是非競爭性抑制劑。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)來源于大豆的庫侖茲型抑制劑抑制胰蛋白酶時是非競爭性抑制劑[10]。本文利用分子對接模擬分析了來源于大豆的Bowman-Birk型抑制劑與胰蛋白酶和糜蛋白酶之間的相互作用，為其抑制這兩種蛋白酶時不同的抑制效率和機理作出了合理解釋。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

委托上海生工生物工程有限公司合成BBTI成熟基因序列。實驗中使用的菌體大腸桿菌Escherichiacoli（ BL21）來自實驗室。重組胰蛋白酶和重組糜蛋白酶購自上海雅心生物技術(shù)有限公司。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）、N-乙?；?L-酪氨酸乙酯（ATEE）、天然BBTI均購自美國Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 rBBTI的誘導(dǎo)表達和親和純化 將質(zhì)粒pet-28a-UPL-BBTI轉(zhuǎn)化到菌體E. coli（BL21）中，進行誘導(dǎo)表達鑒定和培養(yǎng)，再將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的融合蛋白UPLBBTI進行分離純化。融合蛋白UPL-BBTI制備過程中使用的緩沖液為pH值8.0的25 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl），鎳柱親和純化后得到的融合蛋白UPL-BBTI，經(jīng)SUMO（Small Ubiquitin-Like Mod ifier）酶酶切后，用陰離子交換樹脂DEAE-FF進行陰離子層析柱分離純化，并用pH 8.0的150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl和pH 8.0的450 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl溶液等體積線性洗脫，分步收集洗脫液，測定rBBTI活性，且合并有活性的樣品。

1.2.2 抑制劑的抑制活性測定方法 抑制劑的活性測定參照中國藥典的方法[11]，根據(jù)有無抑制劑時胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的差異計算抑制劑活性。

1.2.3 抑制劑最適溫度及溫度穩(wěn)定性 將陽性對照組U0和實驗組U1，在不同溫度（4、16、25、37、55 ℃）中分別孵育2 h后測定抑制劑的活性：以最適溫度下抑制劑的活性為100%，計算其他溫度下抑制劑的相對活性：以溫度為橫坐標，抑制劑的相對活性為縱坐標作圖。

抑制劑的熱穩(wěn)定性實驗，用經(jīng)上述不同溫度處理后的抑制劑，替換實驗組U1反應(yīng)體系中的抑制劑，每2 h測定一次經(jīng)不同溫度處理后的抑制劑活性。結(jié)果為3組平行實驗平均值：規(guī)定未經(jīng)處理抑制劑的活性為100%，計算經(jīng)不同溫度和時間處理后的抑制劑的殘留活性，以溫度為橫坐標，以抑制劑的殘留活性為縱坐標作圖。

1.2.4 抑制劑最適 pH 及 pH 穩(wěn)定性 將陽性對照組U0和實驗組U1中的測活緩沖液分別替換為不同pH值的緩沖液，并放置于25 ℃下，2 h后測定抑制劑的活性。以最適pH值的活性為100%，計算其他pH 條件下的相對活性，以pH值為橫坐標，相對活性為縱坐標作圖。不同pH值緩沖溶液包括100 mmol/L HAc-NaAc（pH 3.0～6.0）, 100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0～8.0）和100 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉Gly-NaOH（pH 9.0～11.0）。

測定pH值對抑制劑穩(wěn)定性的影響，用經(jīng)不同pH值緩沖液處理12 h后的抑制劑，替換實驗組U1中的抑制劑，測定抑制劑的殘余活性，結(jié)果為3組平行實驗平均值：未經(jīng)處理抑制劑的活性為100%，以 pH 為橫坐標，抑制劑的殘留活性為縱坐標作圖。

1.2.5 測定IC50值和抑制動力學(xué)參數(shù) 改變測活體系中抑制劑的濃度，分別測定抑制相同量的胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制率，將抑制胰蛋白酶或糜蛋白酶一半活性所需的量定義為抑制劑抑制該酶的IC50值。以反應(yīng)體系中抑制劑的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，同時計算出IC50值。通過改變底物濃度，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖方法，測定抑制常數(shù)Ki。公式如式（1）所示：

其中：Umax和U'max分別為無抑制劑和有抑制劑時酶活性的最大值;ρ為抑制劑的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2 結(jié)果和討論

2.1 融合蛋白UPL-BBTI的誘導(dǎo)表達和純化

圖1（a）示出了融合蛋白UPL-BBTI誘導(dǎo)表達鑒定。從圖1（a）中可以看出融合蛋白UPL-BBTI在E. coli（BL21）中成功以可溶形式表達，表觀分子量為28 kDa。經(jīng)過兩步純化后，SDS-PAGE電泳檢測顯示，rBBTI所在泳道為單一條帶，見圖1（c），純化效率由表1所示。相比較之前利用大腸桿菌重組系統(tǒng)得到rBBTI的方式[12-13]，本文的方法增加了rBBTI的表達量，融合蛋白的可溶性表達形式避免了包涵體變復(fù)性操作，純化方式簡單且具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。

2.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

圖2所示為rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度。由圖2可知，BBTI和rBBTI活性的最適溫度一致，抑制胰蛋白酶時為25 ℃，抑制糜蛋白酶時為16 ℃。當(dāng)溫度超過37 ℃，抑制劑的活性明顯下降，溫度為55 ℃時，rBBTI的活性基本喪失，但BBTI仍有15%的活性。

圖1 融合蛋白UPL-BBTI誘導(dǎo)表達（a），Ni柱純化UPL-BBTI（b）和DEAE-FF層析分離純化rBBTI和UPL（c）Fig. 1 Induced expression of fusion protein UPL-BBTI (a), purification of UPL-BBTI with Ni column affinity chromatograph (b)and separation and purification of rBBTI and UPL with DEAE-FF anion-exchange (c)

表1 rBBTI的純化效率Table 1 rBBTI Purification efficiency

圖2 rBBTI（a）和BBTI（b）抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度Fig. 2 Optimal temperature of rBBTI （a） and BBTI （b） inhibiting trypsin and chymotrypsin

BBTI和rBBTI放置在4、16、25 ℃溫度條件下活性均比較穩(wěn)定，37、55 ℃的溫度條件下放置4 h以后，活性逐漸降低。在55 ℃下放置10 h后，抑制胰蛋白酶的活性殘留率為原來活性的50%左右，抑制糜蛋白酶活性殘留率為原來活性的45%左右，見圖3。總體而言，BBTI和rBBTI都具有較好的溫度穩(wěn)定性，這與以往對于BBTI的報道一致。BBTI空間結(jié)構(gòu)中的7對保守的二硫鍵以及兩個活性域中的反平行β片層結(jié)構(gòu)，共同決定了BBTI較好的熱穩(wěn)定性特征[2,14]。

2.3 最適 pH和 pH 穩(wěn)定性

圖4示出了rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適pH。由圖4可知，當(dāng)pH值為8時，rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶的活性達到最大；當(dāng)pH值為9時，rBBTI和BBTI抑制糜蛋白酶的活性達到最大；在酸性或堿性條件下，rBBTI和BBTI的活性較低。當(dāng)pH值為3時，rBBTI活性全部喪失；當(dāng)pH值高于10時，rBBTI和BBTI活性明顯降低，見圖4；相比強酸或強堿條件，pH 值在 6～10 范圍內(nèi)，rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶效率較高。

圖3 rBBTI抑制胰蛋白酶（a）、rBBTI抑制糜蛋白酶（b）、BBTI抑制胰蛋白酶（c）和BBTI抑制糜蛋白酶（d）的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of rBBTI inhibiting trypsin (a) , rBBTI inhibiting chymotrypsin (b), BBTI inhibiting trypsin (c) and BBTI inhibiting chymotrypsin (d)

圖4 rBBTI（a）和 BBTI（b）抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適pHFig. 4 Optimal pH of rBBTI (a) and rBBTI (b) inhibiting trypsin and chymotrypsin

BBTI和rBBTI在不同pH值下放置12 h后，殘留的活性如圖5所示，二者的活性變化趨勢一致，當(dāng)pH值范圍在7～9時，抑制活性相對穩(wěn)定。BBTI和rBBTI在pH = 8條件下，抑制胰蛋白酶的活性最穩(wěn)定，在pH =7條件下，抑制糜蛋白酶的活性最穩(wěn)定。

2.4 動力學(xué)參數(shù)測定

2.4.1 IC50值 BBTI和rBBTI抑制蛋白酶活性的抑制曲線如圖6所示，rBBTI在抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的IC50值分別為0.13 mg/mL和0.8 mg/mL，顯然rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制效率不同。BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的IC50值分別為0.048 mg/mL和0.05 mg/mL，在抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶時的抑制效率差異較小。

圖5 rBBTI（a）和 BBTI（b）的pH穩(wěn)定性Fig. 5 pH Stability of rBBTI (a) and BBTI（b）

圖6 rBBTI抑制胰蛋白酶活性（a）、rBBTI抑制糜蛋白酶活性（b）、BBTI抑制胰蛋白酶活性（c）和BBTI抑制糜蛋白酶活性（d）的抑制曲線Fig. 6 Inhibition curves of rBBTI inhabiting trypsin activity (a), rBBTI inhabiting chymotrypsin activity (b), BBTI inhabiting trypsin activity(c) and BBTI inhabiting chymotrypsin activity (d)

2.4.2 抑制常數(shù)Ki值 通過Lineweavek Burk 雙倒數(shù)方法作圖得到圖7（圖中V代表反應(yīng)速度，S代表底物濃度）。圖7（a）反映出BBTI和rBBTI在抑制胰蛋白酶時呈現(xiàn)出的典型的反競爭性抑制劑的特征；而圖7（b）可以表明BBTI和rBBTI在抑制糜蛋白酶時表現(xiàn)出了非競爭性抑制劑的特征。BBTI和rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的動力學(xué)參數(shù)測定結(jié)果見表2，胰蛋白酶和BAEE反應(yīng)時，米氏常數(shù)（Km）為4.9×10?5mol/L，最大反應(yīng)速度（Vmax）為60 μmol/min，當(dāng)加入rBBTI后，Km為2.0×10?5mol/L，Vmax為 28 μmol/min，Ki值 為4.7×10?2mol/L，當(dāng) 加 入BBTI時，Km為1.0×10?5mol/L，Vmax為20 μmol/min，Ki值為7.8×10?3mol/L。對比BBTI和rBBTI的Ki值以及IC50值，發(fā)現(xiàn)rBBTI可以有效抑制胰蛋白酶，其抑制效率略微低于BBTI。

圖7 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法分析rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶（a）和糜蛋白酶（b）的動力學(xué)Fig. 7 Lineweaver-Burk plots analysis of the kinetics of rBBTI and BBTI inhibiting trypsin (a) and chymotrypsin (b)

表2 rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of rBBTI and BBTI to inhibit trypsin and chymotrypsin

以糜蛋白酶和ATEE為底物反應(yīng)的Km為2.6×10?4mol/L，Vmax為265 μmol/min，加入rBBTI后，Km為2.5×10?4mol/L，Vmax為122 μmol/min，Ki值為1.7×10?1mol/L；當(dāng)加入BBTI時，Km為2.3×10?4mol/L，Vmax為63 μmol/min，Ki值為5.0×10?2mol/L。根據(jù)BBTI和rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的動力學(xué)特征參數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者在抑制胰蛋白酶時是一種反競爭性抑制劑[15]，抑制糜蛋白酶時是一種非競爭性抑制劑[16]。導(dǎo)致BBTI和rBBTI抑制效率差異的主要原因可能是BBTI的純度比rBBTI的純度高。

BBTI和rBBTI抑制胰蛋白酶的效率均比抑制糜蛋白酶的效率高，抑制常數(shù)Ki也表明了抑制劑與胰蛋白酶之間的親和力強弱。已有的二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明BBTI與胰蛋白酶之間主要存在氫鍵相互作用，而且比BBTI與糜蛋白酶之間的疏水相互作用要強[17]。BBTI活性位點P1的LYS殘基可與胰蛋白酶活性域的氨基酸殘基形成4對氫鍵，首先LYS-16的羧基可分別和GLY-193、SER-195的主鏈氨基形成鍵長為2.8、2.3 nm的氫鍵，同時LYS-16的氨基與SER-214的羧基形成鍵長為2.8 nm的氫鍵，除此之外，ASN-18與PHE-41主鏈的氨基形成了鍵長為2.5 nm的氫鍵（見圖8(a)）。在胰蛋白酶的活性域中，ASP-189為胰蛋白酶與底物（BAEE）的結(jié)合位點[18]，胰蛋白酶的催化三聯(lián)體（HIS?57?ASP?102?SER?195）通過電子傳遞對底物進行作用，當(dāng)BBTI抑制胰蛋白酶時，BBTI活性位點的LYS-16會與胰蛋白酶三聯(lián)體中的SER-195形成氫鍵，影響胰蛋白酶催化底物時催化三聯(lián)體之間的電子傳遞效率，使BBTI表現(xiàn)出能有效地抑制胰蛋白酶的特征。BBTI抑制胰蛋白酶時，BBTI和底物分別作用于胰蛋白酶的不同位點，這符合BBTI作為反競爭性抑制劑的特征，且在實驗過程中發(fā)現(xiàn)在體系中先加入底物再加入rBBTI的抑制率,比先加入相同量rBBTI再加入底物的抑制效率更高，這恰好符合反競爭抑制劑在抑制酶活性時，反應(yīng)體系中酶先與底物結(jié)合后再與抑制劑結(jié)合的特點。

圖8 BBTI與胰蛋白酶之間的氫鍵作用（a）和BBTI與糜蛋白酶之間的疏水作用（b）Fig. 8 Hydrogen bond interaction of BBTI with trypsin （a） and hydrophobic interaction of BBTI with chymotrypsin （b）

而BBTI和糜蛋白酶之間主要存在相對較弱的疏水作用，BBTI的糜蛋白酶活性域中存在疏水鏈（ILE-40,PHE-50, MET-27, VAL-52)[19]，當(dāng)BBTI靠近糜蛋白酶的活性域時，BBTI的疏水鏈上殘基的側(cè)鏈會明顯地旋轉(zhuǎn)而更利于與糜蛋白酶的疏水性殘基（LEU-97，ILE-95，TRP-215）形成疏水接觸面[20]（圖8(b)）。除此之外，BBTI的P2位點LEU-43殘基的羧基，可與糜蛋白酶SER-195主鏈的氨基形成鍵長為2.6 nm微弱氫鍵，BBTI主要通過疏水作用靠近糜蛋白酶的催化位點，沒有和底物競爭同一個結(jié)合位點（SER-189），這也正符合BBTI抑制糜蛋白酶為非競爭性抑制劑的實驗結(jié)果。BBTI與上述兩種蛋白酶之間相互作用的差異，是BBTI抑制兩種酶效率不同的主要原因。

3 結(jié) 論

（1）利用新的重組表達系統(tǒng)成功實現(xiàn)了BBTI的可溶性表達，通過簡單且有效的純化方式得到了rBBTI。

（2）對比研究了天然BBTI和rBBTI的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)BBTI和rBBTI抑制胰蛋白酶的最適條件是pH 8，25 ℃，抑制糜蛋白酶的最適條件是pH 9，16 ℃。

（3）天然BBTI和rBBTI的抑制動力學(xué)研究表明，抑制胰蛋白酶時是一種反競爭性抑制劑，抑制糜蛋白酶時是一種非競爭性抑制劑，且兩者抑制胰蛋白酶時效率更高。