鄭余銀，馮藝佳，阮青青，屠文展

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325015

帕金森?。≒arkinson"s disease，PD）是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表征為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩，部分患者伴有焦慮、抑郁、記憶減退等精神類障礙[1]。左旋多巴胺藥物被廣泛應(yīng)用于PD患者治療中，但該藥物對(duì)靜止性震顫無效，且會(huì)造成腸胃不適、惡心等不良反應(yīng)，同時(shí)，長期服用左旋多巴胺的PD患者表現(xiàn)出對(duì)藥物不敏感，且伴隨易動(dòng)癥[2-4]。因此，尋找新的用于緩解或治療PD的藥物具有重要的臨床和社會(huì)價(jià)值?？Х纫蚴强Х鹊闹饕钚猿煞种?，大量的流行病學(xué)調(diào)查表明長期飲用咖啡可有效延緩PD的病理進(jìn)程[5-7]。LUAN等[8]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期飲用咖啡因可有效減輕小鼠紋狀體由α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）聚集引起的細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，但咖啡因在PD病理進(jìn)程中的保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究通過在小鼠海馬腦區(qū)注射α-Syn纖維體，模擬α-Syn在海馬腦區(qū)累積而引起的認(rèn)知功能障礙，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探討咖啡因緩解α-Syn造成認(rèn)知功能受損的可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0011。飼養(yǎng)環(huán)境為（23±2）℃，12 h/12 h光照/暗周期。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范均按照溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 試劑和儀器：α-Syn纖維體（No.SPR-317）購自加拿大StressMarq公司；咖啡因（Cat#C0750）和戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；DAB試劑盒（abs957）購自上海Absin公司；α-Syn抗體（ab209538）購自英國Abcam公司；RNA提取試劑TRIzolTM（15596026）購自美國Thermo Fisher公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒（RR037A）購自日本Takara公司；SYBR Green試劑購自美國BIO-RAD公司；光學(xué)顯微鏡DFC7000 T購自德國Leica公司；腦立體定位儀（68507）購自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 α-Syn誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型的建立：按照HU等[9]的方法，利用腦立體定位注射技術(shù)，將5 μg（溶于3 μL PBS溶液）α-Syn纖維體或同等體積的無菌PBS注射到10周齡雄性小鼠雙側(cè)海馬區(qū)（坐標(biāo)：AP，-2.2 mm；ML，±1.5 mm；DV，-2.3 mm）。

1.2.2 分組與處理：根據(jù)LUAN等[8]的方法，將咖啡因溶于飲用水中（1 g/L）。實(shí)驗(yàn)分為3組：PBS造模飲水組（PBS組，n=10），α-Syn造模飲水組（α-Syn組，n=9）和α-Syn造?？Х纫蛱幚斫M（α-Syn-Caff組，n=10）。α-Syn造模后，連續(xù)3個(gè)月每天給予實(shí)驗(yàn)小鼠咖啡因或水飲用。

1.2.3 α-Syn免疫組織化學(xué)染色：用二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）進(jìn)行α-Syn染色。α-Syn造模3個(gè)月后，每組3只小鼠進(jìn)行深度麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）；PBS及PFA灌注后取腦組織進(jìn)行石蠟包埋并制備切片（30 μm）；腦片經(jīng)2 h烘烤（55～60 ℃）、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)后，滴加3% H2O2，室溫孵育10 min，PBS洗3次；5%羊血清封閉30 min后，滴加α-Syn抗體，4 ℃過夜；PBS洗3次，用DAB試劑顯色后，進(jìn)行蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明及封片，顯微鏡下進(jìn)行觀察拍攝。

1.2.4 Y迷宮實(shí)驗(yàn)：Y迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的工作記憶，將實(shí)驗(yàn)小鼠放置于Y迷宮的A臂，記錄5 min內(nèi)小鼠在Y迷宮中的進(jìn)臂順序。如：A-B-C，AC-B記為正確順序，A-B-A或A-C-A記為錯(cuò)誤順序。統(tǒng)計(jì)正確率來評(píng)估小鼠的工作記憶能力[10]。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析：Y迷宮實(shí)驗(yàn)后，小鼠麻醉（0.3%戊巴比妥鈉）并用PBS灌注后，于冰板上迅速分離海馬組織，液氮速凍后-80 ℃保存。利用TRIzol法提取總RNA，A260/280=1.9～2.0符合建庫要求，并送至北京諾禾致源技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及后續(xù)生物信息學(xué)分析[差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：log2（fold change）＞1.3]。

1.2.6 熒光定量PCR（qPCR）：對(duì)應(yīng)樣本的RNA（1 μg）經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用SYBR-Green法進(jìn)行熒光定量，檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。各基因qPCR的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad 5.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長期飲用咖啡因有效改善α-Syn引起的工作記憶障礙 DAB染色觀察α-Syn的聚集情況。α-Syn蛋白在造模飲水組小鼠海馬腦區(qū)有明顯聚集，呈胞體樣結(jié)構(gòu)，證明造模成功。相較于α-Syn組，α-Syn-Caff組小鼠的α-Syn聚集明顯較少，見圖1A。Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于PBS組小鼠，α-Syn造模后，小鼠在Y迷宮中的進(jìn)臂順序正確率明顯下降（P＜0.05），表明其工作記憶表現(xiàn)能力受損；而α-Syn-Caff組相較于α-Syn組，其工作記憶能力有顯著改善（P＜0.05），見圖1B。

圖1 咖啡因改善α-Syn誘導(dǎo)的工作記憶障礙

圖2 α-Syn蛋白引起海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化

2.2 α-Syn蛋白促進(jìn)海馬腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化 通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于PBS組，α-Syn組在轉(zhuǎn)錄水平上有431個(gè)基因顯著上調(diào)（P＜0.05），232個(gè)基因下調(diào)（P＜0.05），見圖2A。經(jīng)KEGG聚類分析后發(fā)現(xiàn)：差異基因主要集中在破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)吞及趨化反應(yīng)等信號(hào)通路，見圖2B。在α-Syn組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜中，Tmemll9和Cx3crl表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），隨后用qPCR驗(yàn)證了這一結(jié)論；此外，Trl9在α-Syn組也呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.05），見圖2C。

2.3 長期飲用咖啡因增強(qiáng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的增殖能力 在對(duì)α-Syn組和α-Syn-Caff組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異基因分析，發(fā)現(xiàn)有363個(gè)基因上調(diào)（P＜0.05），277個(gè)基因下調(diào)（P＜0.05），見圖3A。我們對(duì)這些差異基因進(jìn)行KEGG聚類發(fā)現(xiàn)：只有趨化因子信號(hào)顯著上調(diào)（P＜0.05），這說明咖啡因可能增強(qiáng)了對(duì)病變周圍免疫細(xì)胞的招募，對(duì)損傷組織進(jìn)行修復(fù)（見圖3B）。但是，咖啡因?qū)Ζ?Syn引起的小膠質(zhì)細(xì)胞分化、內(nèi)吞作用及免疫調(diào)節(jié)均無顯著改善。因此，我們對(duì)差異基因進(jìn)行GO注釋分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于α-Syn組，α-Syn-Caff組富集的功能注釋主要集中在細(xì)胞增殖（包括干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞）和調(diào)節(jié)突觸傳遞方面，見圖3C。我們對(duì)參與細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因Sox2和VEGFA進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)咖啡因飲用可以顯著誘導(dǎo)Sox2和VEGFA轉(zhuǎn)錄表達(dá)（P＜0.05），見圖3D。

3 討論

研究表明α-Syn纖維體被神經(jīng)元吸收，誘導(dǎo)正常的內(nèi)源性α-Syn向其聚集，從而形成包涵體并在大腦中呈現(xiàn)朊病毒樣擴(kuò)散。異常聚集的α-Syn可通過氧化應(yīng)激、細(xì)胞毒性等方式造成神經(jīng)元的損失[11-12]。LUK等[13]在腦區(qū)注射α-Syn纖維體模擬PD的認(rèn)知障礙和運(yùn)動(dòng)障礙。本研究選擇海馬注射α-Syn纖維體模擬PD的病理特征及認(rèn)知功能缺陷表型，來探討咖啡因的認(rèn)知功能保護(hù)作用機(jī)制。

圖3 長期飲用咖啡因有效增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力

部分PD患者在運(yùn)動(dòng)癥狀之前就表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能障礙，這可能與α-Syn在腦內(nèi)的擴(kuò)散方式有關(guān)。當(dāng)α-Syn擴(kuò)散并異常聚集在參與認(rèn)知的腦區(qū)或神經(jīng)元時(shí)，伴隨著神經(jīng)元的退行性病變，認(rèn)知能力會(huì)逐漸下降。在模型中，在海馬神經(jīng)元注射α-Syn 3個(gè)月后，α-Syn蛋白在該腦區(qū)大量聚集，小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知缺陷；而飲用咖啡因后α-Syn的聚集大量減少，且有效緩解其造成的工作記憶能力損傷。這一結(jié)論與LUAN等[8]和HU等[9]在紋狀體腦區(qū)注射α-Syn并給予咖啡因處理的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了咖啡因?qū)D認(rèn)知功能的保護(hù)作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，尤其是促炎M1型的分化是PD病理的主要變化之一。一直以來，關(guān)于α-Syn促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子機(jī)制是PD的研究熱點(diǎn)之一。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及促炎因子的釋放一直被認(rèn)為是神經(jīng)退行性病變的共同病理表現(xiàn)。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為：小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是由于α-Syn、Aβ或Tau蛋白等異常聚集引起的[14-16]。有研究指出α-Syn可通過與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的TLR受體相互作用來激活膠質(zhì)細(xì)胞[17]。近期的多巴胺神經(jīng)元移植實(shí)驗(yàn)表明，α-Syn引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能參與了PD病理的發(fā)生發(fā)展，小膠質(zhì)細(xì)胞在α-Syn病理性聚集及傳播中發(fā)揮了重要的作用[18]。Tmem119是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡因飲用可有效降低Tmem119的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05）。這暗示著咖啡因可有效減輕α-Syn引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)。隨著對(duì)Tmem119操控技術(shù)的發(fā)展[20]，抑制Tmem119可能是潛在的有效緩解PD的治療策略。

ALE-AGHA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚受到紫外線損傷時(shí)，咖啡因會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的DNA修復(fù)；咖啡因還可以促進(jìn)p27蛋白（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B）向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)心臟細(xì)胞的抗損傷能力。另有研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠適量的咖啡因，可促使衰老小鼠的心肌功能得到極大改善，同時(shí)加快心肌受損后的修復(fù)[22]。在轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，咖啡因的主要功能也是富集在促細(xì)胞增殖信號(hào)通路。這說明在PD的病理進(jìn)程中，咖啡因的保護(hù)作用可能正是增強(qiáng)了神經(jīng)元及其他類型細(xì)胞的修復(fù)及增殖能力來對(duì)抗α-Syn的損傷作用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)咖啡因可有效改善海馬腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，并改善小鼠的認(rèn)知功能障礙，為闡明咖啡因?qū)D的保護(hù)機(jī)制提供了新證據(jù)。