陳超 李冬 童國(guó)俊 胡四平

食管腺癌已成為發(fā)病率最高的食管惡性腫瘤，也是生長(zhǎng)速度最快、最具侵襲性的惡性腫瘤之一[1-2]。由于目前食管腺癌的預(yù)后仍極不理想，探索食管腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后影響因素是食管腺癌治療的基礎(chǔ)。微小非編碼 RNA（microRNA，miRNA）可通過(guò)識(shí)別 mRNA上的miRNA應(yīng)答元件抑制mRNA的翻譯或?qū)е耺RNA降解，同時(shí)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）上也存在miRNA應(yīng)答元件并競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA[3]。因此，lncRNA、miRNA、mRNA之間形成的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)是食管癌預(yù)后機(jī)制研究的重要突破點(diǎn)，可能為食管腺癌患者的治療提供新的方法。癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了大量的腫瘤標(biāo)本的數(shù)據(jù)，包括數(shù)百例食管惡性腫瘤患者的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及相對(duì)應(yīng)的臨床基本信息。然而，關(guān)于食管腺癌中的ceRNA網(wǎng)絡(luò)及其影響預(yù)后的機(jī)制目前仍知之甚少。本研究提取食管腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息分析手段構(gòu)建食管腺癌預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，以進(jìn)一步探索食管腺癌預(yù)后影響機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇截至2019年7月從TCGA獲取78例食管腺癌組織和13例正常食管組織的lncRNA、miRNA、mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)，以及食管腺癌組織患者性別、年齡、病理分期等臨床數(shù)據(jù)。食管腺癌患者男67例，女11例，年齡 68.4（58.0～77.1歲），生存期為 2.15（1.01～4.88）年；按腫瘤病理分期，處于Ⅰ期、Ⅳ期各10例（12.8%），Ⅱ期25例（32.1%），Ⅲ期 33例（42.3%），13例正常食管組織TCGA未提供臨床信息。

1.2 方法

1.2.1 差異基因篩選 采用R軟件分析食管腺癌組織和正常食管組織中存在差異表達(dá)的lncRNA、miRNA、mRNA。差異基因的篩選條件：（1）lncRNA、miRNA的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）以2為底的對(duì)數(shù)的絕對(duì)值（|log2FC|）均為≥1；（2）mRNA 的|log2FC|≥0.6；（3）P＜0.05。以lncRNA、miRNA、mRNA的表達(dá)量的中位值將食管腺癌樣本分為各基因所對(duì)應(yīng)的高表達(dá)組和低表達(dá)組，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)差異表達(dá)的lncRNA、miRNA、mRNA的基因數(shù)。

1.2.2 生存分析及權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 用Kaplan-Meier法分析食管腺癌組織中各lncRNA、miRNA、mRNA的表達(dá)量的多少與生存時(shí)間的關(guān)系，若P＜0.05即說(shuō)明該基因?yàn)槭彻芟侔╊A(yù)后相關(guān)基因。用R軟件對(duì)差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的lncRNA和miRNA、miRNA和mRNA構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，以無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)指數(shù)＞0.85為符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)條件并確定軟閾值。計(jì)算并獲得lncRNA與miRNA、miRNA與mRNA的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 以miRNA為中心，在權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中篩選與miRNA存在共表達(dá)關(guān)系的mRNA，同時(shí)逆向篩選可吸附miRNA并與預(yù)后相關(guān)的lncRNA，構(gòu)建lncRNA/miRNA/mRNA內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape軟件中可視化；再次采用生存分析評(píng)估ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各種RNA在食管腺癌組織、正常食管組織中的表達(dá)差異，以及miRNA與lncRNA、mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

1.2.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA） 將食管腺癌組織分別分為細(xì)胞周期蛋白激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）高表達(dá)組、CDK1 低表達(dá)組、微管成核因子（microtubule nucleation factor,TPX2）高表達(dá)組、TPX2低表達(dá)組，隨后進(jìn)行GSEA研究京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）結(jié)果。對(duì)富集分析結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES）進(jìn)行排序，對(duì)各組中NES排名前5的KEGG通路結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及可視化采用R軟件（3.6.1版）、Cytoscape軟件（3.7.2版）。計(jì)量資料如呈正態(tài)分布以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，否則以四分位數(shù)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。分類變量采用例數(shù)（百分率）表示，生存資料采用log-rank檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 與正常食管組織比較，食管腺癌組織中符合篩選條件被分到高表達(dá)組的lncRNA、miRNA、mRNA分別有678、131、1 862個(gè)，被分到低表達(dá)組的 lncRNA、miRNA、mRNA分別有 774、59、2 825個(gè)。

2.2 生存分析與權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 （1）在所有表達(dá)有差異的lncRNA、miRNA、mRNA中，生存分析結(jié)果提示與預(yù)后相關(guān)的RNA數(shù)目分別有81、20、374個(gè)。（2）由這些與預(yù)后相關(guān)的 lncRNA、miRNA、mRNA組成的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA共有7個(gè)，分別為 AC131009.3、AC024337.2、AC245407.1、BDNF-AS、AL136172.1、AC087388.1、AC010261.2；miRNA 共有 3個(gè)，分別為 miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-29c-3p，而與這3個(gè)miRNA又存在共表達(dá)關(guān)系的預(yù)后相關(guān)的mRNA有7個(gè)，分別為CDK1、TPX2、細(xì)絲蛋白A（filamin A，F(xiàn)LNA），肌肉相關(guān)受體酪氨酸激酶（muscle associated receptor tyrosine kinase，MUSK）、蛋白激酶camp依賴的Ⅱ型調(diào)節(jié)亞基β（protein kinase cAMP-dependent type Ⅱ regulatory subunit beta，PRKAR2B）、非受體5型蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 5，PTPN5）、血管活性腸肽受體 2（vasoactive intestinal peptide receptor 2，VIPR2）。

2.3 食管腺癌預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3.1 預(yù)后相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò) 見圖1。

由圖1可見，在該ceRNA網(wǎng)絡(luò)中AC131009.3、AC087388.1、miR-29c-3p、CDK1、TPX2 互相之間存在內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，即構(gòu)成了ACO87388.1/miR-29c-3p/CDK1、ACO87388.1/miR-29c-3p/TPX2、AC131009.3/miR-29c-3p/CDK1、AC131009.3/miR-29c-3p/TPX2 的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖1 食管腺癌的預(yù)后ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖，菱形為lncRNA，三角形為miRNA，橢圓形為mRNA；深灰色為與正常食管組織比較，在食管腺癌組織中高表達(dá)，淺灰色為食管腺癌組織中低表達(dá)（TPX2為微管成核因子，CDK1為細(xì)胞周期蛋白激酶1，F(xiàn)LNA為細(xì)絲蛋白A，MUSK為肌肉相關(guān)受體酪氨酸激酶，PRKAR2B為蛋白激酶camp依賴的Ⅱ型調(diào)節(jié)亞基β，PTPN5為非受體5型蛋白酪氨酸磷酸酶，VIPR2為血管活性腸肽受體2）

2.3.2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因表達(dá)水平與生存時(shí)間的關(guān)系 見圖2。

由圖 2 可見，AC131009.3、AC087388.1、CDK1、TPX2在食管腺癌組織中的表達(dá)水平越高，患者的生存時(shí)間越短，生存率越低；miR-29c-3p在食管腺癌組織中的表達(dá)水平越高，患者的生存時(shí)間越長(zhǎng)，生存率越高。即miR-29c-3p在食管腺癌中可能是腫瘤抑制基因，AC131009.3、AC087388.1、CDK1、TPX2 在食管腺癌中可能是促腫瘤生長(zhǎng)基因。

圖2 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因表達(dá)水平與生存時(shí)間的關(guān)系

2.3.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因在食管腺癌組織、正常食管組織中的表達(dá)差異 見圖3。

由圖3可見，與正常食管組織比較，在食管腺癌組織中 ACO87388.1、AC131009.3、CDK1、TPX2 的表達(dá)水平更高，而miR-29c-3p在食管腺癌組織中的表達(dá)水平更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因在食管腺癌組織、正常食管組織中的表達(dá)差異趨勢(shì)與食管腺癌患者生存分析結(jié)果相符。

圖3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中各基因在食管腺癌組織、正常食管組織中的表達(dá)差異

2.3.4 miR-29c-3p 表達(dá)量與 ACO87388.1、AC131009.3、CDK1、TPX2表達(dá)量的相關(guān)性分析 見圖4。

由圖4可見，在共表達(dá)分析中，miR-29c-3p的表達(dá)量與ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA（AC087388.1、AC131009.3）、mRNA（CDK1、TPX2）的表達(dá)量存在明顯的Pearson相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.473、-0.564、-0.655、-0.647。

圖4 miR-29c-3p表達(dá)量與ACO87388.1、AC131009.3、CDK1、TPX2表達(dá)量的相關(guān)性分析

2.4 GSEA中的可能與腫瘤相關(guān)的KEGG富集結(jié)果CDK1、TPX2基因參與的可能與腫瘤預(yù)后相關(guān)的KEGG見表1。

由表1可見，KEGG顯示的是CDK1高表達(dá)組、CDK1低表達(dá)組、TPX2高表達(dá)組、TPX2低表達(dá)組中NSE排名前5的KEGG通路；CDK1基因可能參與腫瘤的免疫、細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，TPX2基因主要與腫瘤的代謝等。對(duì)表1進(jìn)行可視化，CDK1和TPX2基因參與的KEGG結(jié)果見圖5（插頁(yè)）。

表1 CDK1、TPX2基因參與的可能與腫瘤預(yù)后相關(guān)的KEGG

圖5 細(xì)胞周期蛋白激酶1（CDK1）和微管成核因子（TPX2）基因參與的KEGG結(jié)果（a：CDK1；b：TPX2）

由圖5可見，GSEA結(jié)果提示 CDK1、TPX2基因在食管腺癌中可參與多種高級(jí)生物學(xué)功能，以及各生物學(xué)功能在CDK1高表達(dá)組、CDK1低表達(dá)組、TPX2高表達(dá)組、TPX2低表達(dá)組中的分布情況。

3 討論

食管腺癌是常見的食管惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)抗癌治療的耐藥率很高，晚期食管癌的5年生存率僅為0.9%[4]。食管腺癌表觀遺傳現(xiàn)象異常引起的生物學(xué)功能改變是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不佳的重要因素之一，而基因表達(dá)水平的改變是表現(xiàn)遺傳現(xiàn)象建立的核心?；虮磉_(dá)水平的異常是導(dǎo)致腫瘤預(yù)后差異的起源，分子間的信號(hào)傳導(dǎo)是預(yù)后改變的重要機(jī)制。Zhang等[5]就曾利用TCGA中的食管腺癌數(shù)據(jù)并采用權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法探索食管腺癌中的預(yù)后基因。近年來(lái)已有大量文獻(xiàn)表明，具有差異表達(dá)的lncRNA、miRNA可能在食管癌患者的預(yù)后中扮演者重要的作用[6-10]。非編碼RNA的生物學(xué)作用主要是通過(guò)復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)最終作用于具有蛋白編碼功能的mRNA而發(fā)揮作用[11]。因此，研究食管腺癌中l(wèi)ncRNA、miRNA、mRNA之間的競(jìng)爭(zhēng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)探索腫瘤的生物學(xué)價(jià)值可能為腫瘤的治療提供新的治療手段[12]。

生物信息分析技術(shù)是一種高效率、精準(zhǔn)確率、高可信度的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，已被《Nature》等知名期刊認(rèn)可[13-14]。本研究中筆者通過(guò)生物信息分析篩選食管腺癌中存在差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的lncRNA、miRNA、mRNA，再挖掘到以miRNA為中心的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方式是多樣化的，例如可以通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)工具或權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)[15-17]，本研究中的ceRNA是通過(guò)分析相應(yīng)樣本中l(wèi)ncRNA、miRNA、mRNA的共表達(dá)關(guān)系的權(quán)重系數(shù)獲得的，研究結(jié)果可能更貼近實(shí)際，可靠性更強(qiáng)。該ceRNA網(wǎng)絡(luò)的核心是miR-29c-3p，多項(xiàng)研究表明miR-29c-3p在ceRNA中可以抑制卵巢癌生長(zhǎng)[18]，在室管膜瘤中可以改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等[19]。在食管腺癌中，Craig等[20]學(xué)者報(bào)道m(xù)iR-29c-3p出現(xiàn)了異常表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。本研究共表達(dá)分析結(jié)果提示miR-29c-3p與ACO87388.1、AC131009.3、CDK1、TPX2 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與CDK1、TPX2的相關(guān)性最為密切（Cor＞-0.6）。然而，食管腺癌中關(guān)于miR-29c-3p在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的作用及其機(jī)制報(bào)道甚少。在現(xiàn)有研究中，ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的ACO87388.1、AC131009.3與惡性腫瘤的相關(guān)性尚不明確，但是已有證據(jù)表明CDK1、TPX2是重要的腫瘤預(yù)后相關(guān)分子[21-23]。因此，進(jìn)一步地研究ceRNA網(wǎng)絡(luò)在食管腺癌中的生物學(xué)作用顯得極為迫切。

lncRNA、miRNA最終是通過(guò)影響mRNA的翻譯或使mRNA降解而發(fā)揮生物學(xué)作用，因此CDK1、TPX2是本研究的核心分子?；贑DK1、TPX2基因RNA表達(dá)量進(jìn)行的GSEA結(jié)果認(rèn)為，本ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能參與了食管腺癌的多種生物學(xué)功能，例如影響食管腺癌的離子通到、細(xì)胞代謝、腫瘤微環(huán)境等途徑從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等。在惡性腫瘤中，離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)因改變了腫瘤的代謝而影響了患者的預(yù)后，是惡性腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)[24-25]。此外，腫瘤微環(huán)境可通過(guò)表達(dá)異常的分子建立強(qiáng)大的腫瘤免疫逃逸系統(tǒng)，在食管鱗癌中腫瘤的微環(huán)境可影響腫瘤的生長(zhǎng)[26]，在食管腺癌也可能存在類似的機(jī)制。

綜上所述，食管腺癌是一種高度惡性的腫瘤，本研究發(fā)現(xiàn) ACO87388.1、AC131009.3、miR-29c-3p、CDK1、TPX2是影響食管腺癌患者的編碼、非編碼基因，以miR-29c-3p為中心的ceRNA可能參與了食管腺癌腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在未來(lái)食管腺癌的預(yù)后分析中存在重要的研究?jī)r(jià)值。本研究?jī)H局限于生物信息的分析研究，研究結(jié)論尚需進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)、臨床研究去證實(shí)，但研究結(jié)果為未來(lái)的研究探索提供了思路。