王端好，王震，胡吉祥，韓孟姚，仲杰

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000）

生料液態(tài)釀酒就是小曲中微生物在液態(tài)中將谷物淀粉先糖化，后發(fā)酵生成酒精和香味香氣物質(zhì)的過程[1]。在釀酒過程中，產(chǎn)胞外水解酶的微生物利用自身代謝所產(chǎn)生的酶將生淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，將蛋白質(zhì)水解為氨基酸等。在無氧的情況下，葡萄糖進入酵母菌細胞后代謝生成乙醇，并排出細胞外，在相關(guān)酶的作用下，產(chǎn)生一些香味香氣成分[2-4]。與傳統(tǒng)熟料工藝相比，可以節(jié)約能源，提高出酒率。由于是在液態(tài)下發(fā)酵，具有操作簡便，便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[5-8]。

清香型白酒香味醇厚而持久，無其它雜味，顏色清亮、透明，口感柔和、協(xié)調(diào)，入口軟而甜、清爽、干凈，深受廣大消費者的喜愛[9]。大米中除含有70%～80%的淀粉之外，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和小分子氨基酸等成分[10-11]，適合作為釀酒原料。我國作為世界上第一大米生產(chǎn)國，利用大米釀酒可以釀造出具有米香味的清香型白酒，同時提高大米的附加值。

本文擬研究以大米為釀酒原料，以小曲為糖化發(fā)酵劑，用生料液態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵生產(chǎn)清香型大米酒生產(chǎn)工藝，并對酒質(zhì)進行檢測，此研究在現(xiàn)有文獻中未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲：黃淮學(xué)院發(fā)酵工程實驗室自制；大米：市售，粉碎至通過網(wǎng)孔2 mm的網(wǎng)篩；鹽酸（分析純）：佛山市華希盛化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（BCD-252KU）：河南新飛電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RH52-3）：上海滬西分析儀器廠有限公司；酒度計（BL501）：深圳市博萊森電子科技有限公司；氣相色譜儀（GC-2014）：日本島津公司；酒精發(fā)酵罐（GD-FJ-100L）：溫州古德輕工機械有限公司；蒸餾器（D35L）：家多寶釀酒機械；網(wǎng)篩：浙江上虞五四儀器篩具廠。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

按照大米、水和小曲 100∶300∶0.8（質(zhì)量比）的比例，在30℃下錐形瓶中密閉發(fā)酵12 d，從第2天開始到第5天，每天定時打開錐形瓶的密封口用玻璃棒兩次攪拌然后再密封；從第3天開始，每天定時檢測一次發(fā)酵液的酒精度；從第6天開始密閉發(fā)酵。

1.3.2 單因素試驗

采用單因素試驗對發(fā)酵溫度、小曲添加量和培養(yǎng)基初始pH值3個因素進行優(yōu)化。優(yōu)化發(fā)酵溫度時，固定小曲添加量為0.8%（以大米為100 g計），培養(yǎng)基初始pH值為7，以發(fā)酵溫度為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳發(fā)酵溫度；優(yōu)化小曲添加量時，固定發(fā)酵溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH值為7，以小曲添加量為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳小曲添加量；優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH值時，固定發(fā)酵溫度為30℃，小曲添加量為0.8%，以培養(yǎng)基初始pH值為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳初始pH值。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗

在單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵溫度、小曲添加量和培養(yǎng)基初始pH值運用Box-Behnken設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，以酒精含量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗設(shè)計見表1[12]。運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析[13]。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平Table 1 Experimental factors and levels in Box-Behnken

1.3.4 小試放大試驗

按照響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，在100 L的帶有攪拌器的厭氧發(fā)酵罐中進行小試放大生產(chǎn)大米酒。從第2天開始到第5天每天定時打開發(fā)酵罐，進行攪拌和換氣兩次，然后密封，從第6天開始密閉發(fā)酵。

1.3.5 酒精檢測

取發(fā)酵液100 mL，添加50 mL去離子水混勻，進行蒸餾，蒸餾溫度75℃，當(dāng)餾出液為20 mL時停止蒸餾，用酒度計檢測酒精含量。

1.3.6 酒質(zhì)檢測

測定甲醇含量的方法參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》；測定乙酸乙酯含量的方法參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度對釀酒結(jié)果影響顯著，溫度對生物體內(nèi)的一系列生物化學(xué)反應(yīng)影響重大，對酶的種類和活性影響也較大，從而影響酶促反應(yīng)速率和方向，進而影響代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量，最適溫度促進微生物的良好生長及其代謝產(chǎn)物的合成[14]。不同發(fā)酵溫度對酒精含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對酒精含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content

如圖1所示，在3 d～11 d期間，各組酒精含量隨著時間的延長持續(xù)增大，到第12天時，酒精含量未明顯增加。發(fā)酵溫度為15、20℃時，發(fā)酵液中的酒精含量均較低。當(dāng)發(fā)酵溫度分別為25、30、35℃時，酒精含量均較高，發(fā)酵液中的微生物的代謝速度快，產(chǎn)酒的速度也快。發(fā)酵溫度為30℃時發(fā)酵液中的酒精含量最高，所以取最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.2 小曲添加量的影響

小曲是釀酒的糖化發(fā)酵劑[15]，曲中含有很多種菌種，其中最主要的是霉菌，以根霉為主的小曲，酒化力最強，因此用它作為糖化發(fā)酵劑用量很少，而且發(fā)酵期短、出酒率高[16]。不同小曲添加量對酒精含量的影響見圖2。

圖2 小曲添加量對酒精含量的影響Fig.2 Effect of addition of xiaoqu on alcohol content

如圖2所示，隨著時間的延長，發(fā)酵液中的酒精含量均逐漸增大；當(dāng)小曲添加量為0.4%和0.6%時，發(fā)酵液中的酒精含量較低。當(dāng)小曲添加量為0.8%、1.0%和1.2%時，發(fā)酵液中的酒精含量較高。小曲添加量為1.0%時，酒精含量最高。小曲添加量高，酒曲的用量大，糖化發(fā)酵劑的量增大，糖化發(fā)酵速度快，但在一定條件下，小曲添加量過大時，由于微生物在糖化發(fā)酵初期生長速率過大，導(dǎo)致局部缺氧，反而使糖化不徹底，酒精生成量降低，導(dǎo)致出酒率降低。故此取最佳小曲添加量為1.0%。

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH值的影響

培養(yǎng)基的pH值影響微生物的細胞結(jié)構(gòu)和酶的活性，從而影響微生物的生長和代謝，進而影響代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量[17]。培養(yǎng)基不同初始pH值對酒精含量的影響見圖3。

如圖3所示，隨著時間的延長，發(fā)酵液中的酒精含量均逐漸增大；培養(yǎng)基初始pH值為6時，酒精度最高，培養(yǎng)基初始pH值為5和7時，酒精含量較低。每一類微生物都有其特定的耐受和最適pH值范圍，在最佳pH值的范圍內(nèi)能夠促進微生物的生長和產(chǎn)物合成，以獲得較高的產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為6時，促進了小曲內(nèi)菌的生長，進而促進了產(chǎn)物的合成，獲得最高產(chǎn)量。所以取培養(yǎng)基最佳初始pH值為6。

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對酒精含量的影響Fig.3 Effect of initial pH of medium on alcohol content

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

按照Box-Behnken試驗原理，設(shè)計了27個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and responses in Box-Behnken

由表2得出二次回歸方程式為Y=-130.631 25+1.345 83A-4.145 83B+50.275 00C-0.125 00AB+9.325 87×10-6AC+0.625 00BC-0.019 917A2+4.739 58B2-4.241 67C2。

計算各項回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立酒精含量（Y）與A發(fā)酵溫度、B小曲添加量和C培養(yǎng)基初始pH值3個因素的數(shù)學(xué)回歸模型。方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸方程解析Table 3 Response surface regression equation analysis

由表3可知，模型的一次項A影響高度顯著，B影響極顯著，C影響不顯著。從F值可以看出，單因素對酒精含量的影響順序依次是A>B>C，即發(fā)酵溫度>小曲添加量>初始pH值。二次項C2影響高度顯著，A2影響極顯著，B2影響不顯著。交互項影響不顯著。從整體分析，模型P<0.000 1，表明該二次多項回歸模型高度顯著，失擬項P不顯著，表明模型與實際情況擬合較好。因此可以采用此模型對大米酒的發(fā)酵工藝條件進行分析和預(yù)測。

對A發(fā)酵溫度、B小曲添加量、C培養(yǎng)基初始pH值3因素兩兩作交互作用分析，其響應(yīng)面見圖4。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。

由圖4可知，發(fā)酵溫度和小曲添加量、培養(yǎng)基初始pH值和小曲添加量之間交互作用顯著。

圖4 響應(yīng)面法各因素交互作用分析Fig.4 Analysis of interaction of various factors by response surface methodology

通過對以上獲得的二次方程回歸模型進行數(shù)學(xué)分析可知，以大米為原料，生料液態(tài)釀酒最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度30.02℃、小曲添加量1.2%、培養(yǎng)基初始pH值6.01，在此優(yōu)化條件下，酒精含量理論值為42.6197°。為了進一步驗證響應(yīng)面分析結(jié)果的可靠性，為方便實際操作，選擇發(fā)酵溫度30℃、小曲添加量為1.2%、培養(yǎng)基初始pH值6作為最優(yōu)條件。重復(fù)3次，測得酒精含量分別為 42.608 8、42.610 5、42.609 9 °，取平均值為42.609 7°。與理論值相比，相對誤差較小。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的生料液態(tài)釀酒工藝參數(shù)準確可靠，可進行下一步放大試驗。

2.3 小試放大試驗結(jié)果

在100 L發(fā)酵罐內(nèi)進行小試放大試驗。發(fā)酵到第3天就開始產(chǎn)生氣體，到了第5天發(fā)酵液就發(fā)出較為強大的酒香味，發(fā)酵10 d后，發(fā)酵液上面一層顏色變深，第12天發(fā)酵液上面一層變?yōu)榭Х壬鹿?。用蒸酒器蒸餾，去酒頭和酒尾，然后進行調(diào)制，出酒率達到每100 kg大米生產(chǎn)出50°白酒109.5 kg。酒體清亮、透明，入口柔和、協(xié)調(diào)，并具有大米的清香味。

2.4 酒質(zhì)檢測結(jié)果

對發(fā)酵試驗生產(chǎn)出的原漿50°成品酒進行品評，具有“清香醇厚、綿柔回甜、尾凈爽口、回味悠長”的特點，同時還具有大米特有的清香味。

酒體中最重要的香味物質(zhì)是乙酸乙酯，乙酸乙酯的含量決定了酒體的質(zhì)量，而甲醇卻是有害物質(zhì)，含量過高會對人體造成傷害，所以甲醇在酒體中的含量要低于國家標準。因此，需要對成品酒中的乙酸乙酯和甲醇的含量進行鑒定分析。用氣相色譜檢測的圖譜見圖5，氣相色譜檢測結(jié)果分析見表4，成品酒鑒定結(jié)果見表5。

圖5 氣相色譜檢測圖譜Fig.5 Gas chromatographic detection atlas

表4 氣相色譜檢測結(jié)果分析Table 4 Analysis table of gas chromatography detection results

表5 成品酒鑒定結(jié)果Table 5 The detection results of the wine

由此可知，成品酒中乙酸乙酯含量為0.43 g/L，根據(jù)GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》的標準，該成品酒符合國家一級白酒的標準；甲醇含量僅為0.08 g/L，遠遠低于國家標準，質(zhì)量安全。因此該大米酒符合國家標準，可有計劃的大力推廣生產(chǎn)。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面分析，建立了發(fā)酵生產(chǎn)大米酒中含量酒精的二次多項式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測酒精產(chǎn)量。確定小曲生料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大米清香型白酒的最終優(yōu)化工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度30℃、小曲添加量1.2%、培養(yǎng)基初始pH值為6。在發(fā)酵罐進行小試發(fā)酵12 d時50°白酒出酒率達到109.5%，出酒率高于現(xiàn)有文獻報道的數(shù)量。

該大米酒酒體清亮、透明，入口柔和、協(xié)調(diào)，并具有大米的清香味。通過氣相色譜檢測，乙酸乙酯含量為0.43 g/L，符合國家一級清香型白酒的標準；甲醇含量僅為0.08 g/L，遠低于國家標準，質(zhì)量安全。該產(chǎn)品成本低，勞動強度小，出酒率高，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)，為下一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。