曹卓松，孫飛龍，李辰宇，楊曉波，王尚，薛斌，趙辰，張曦，諶志強(qiáng)，王景峰，邱志剛*

（1.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710600；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

電化學(xué)生物傳感器是通過測(cè)量電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)微生物的生物傳感器，這種傳感器是以生物敏感材料（如抗體等）作為識(shí)別元件特異性識(shí)別待測(cè)物，以電極（如玻碳固體電極等）作為轉(zhuǎn)換元件將物理或化學(xué)變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，通過信號(hào)放大并處理從而實(shí)現(xiàn)定性或定量分析待測(cè)物[1]。近年來電化學(xué)生物傳感器隨著材料、生物、電化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展也取得了巨大進(jìn)步，各領(lǐng)域?qū)W者也報(bào)道了大量新型電化學(xué)生物傳感器。

大腸桿菌是廣泛存在于水體中的一類致病菌，人體感染其可引起闌尾炎、膽囊炎等疾病，嚴(yán)重情況甚至可導(dǎo)致死亡[2-3]。傳統(tǒng)檢測(cè)大腸桿菌的方法主要有操作復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)的濾膜法、多管發(fā)酵法等，其缺點(diǎn)是很難滿足污染源快速檢測(cè)的需求。近年來發(fā)展的許多檢測(cè)方法[如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[4-5]、免疫學(xué)檢測(cè)[6-7]等]均具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但仍達(dá)不到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的時(shí)間要求。因此，電化學(xué)生物傳感器因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短的優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展起來。

本文介紹了電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)原理及常用的檢測(cè)技術(shù)，探討了電化學(xué)生物傳感器在大腸桿菌檢測(cè)方面的傳感原理及應(yīng)用成果，并對(duì)電化學(xué)生物傳感器發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 大腸桿菌

1.1 生物學(xué)特性及致病性

大腸桿菌，又稱大腸埃希氏菌（Escherichia coli），是一種兩端鈍圓的短桿菌，屬腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌種，大量存在于恒溫動(dòng)物腸道內(nèi)，是腸道內(nèi)正常棲息菌，可隨糞便排出后在自然界廣泛散播，因此環(huán)境內(nèi)檢出大腸桿菌則表明被糞便感染。所以從大腸桿菌被發(fā)現(xiàn)開始，其就被作為食品類糞源污染的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)及水體衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)的微生物指標(biāo)[8]。

大部分大腸桿菌無致病性，少部分菌種可產(chǎn)生腸毒素，能導(dǎo)致腸胃炎等疾病，是食物中毒主要原因之一[9]。若人體其他組織器官遭到大腸桿菌侵染，還可引起尿道炎、膀胱炎等疾病，甚至還能導(dǎo)致免疫力較弱人群引起敗血癥[10]。

1.2 檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀

目前世界普遍采用的大腸桿菌檢測(cè)方法有稀釋平板計(jì)數(shù)法、多管發(fā)酵法和濾膜法[11]。其中前兩者適用范圍廣，但操作繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)；而濾膜法僅適用于雜質(zhì)較少的水樣，較前兩者操作相對(duì)簡(jiǎn)單；這幾種傳統(tǒng)方法在檢測(cè)周期、檢測(cè)效率等方面都存在不足，無法滿足快速檢測(cè)的需求[12]。近年來除了傳統(tǒng)的檢測(cè)方法外，在各界學(xué)者的大量研究下也發(fā)展了許多檢測(cè)大腸桿菌的新方法，如PCR法、免疫法、酶底物法、電化學(xué)法等。

PCR技術(shù)，在檢測(cè)大腸桿菌方面具有快速靈敏等優(yōu)勢(shì)，其原理是以擴(kuò)增的目標(biāo)DNA為模板，將與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物，在DNA聚合酶作用下沿著模板延伸至完成新的DNA的合成，目前大腸桿菌PCR技術(shù)主要是針對(duì)致病性大腸桿菌的致病基因[13]。但該方法也存在反應(yīng)效率差異大、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度有限等不足。

免疫法是基于抗原抗體之間特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種方法，其通過對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行示蹤物標(biāo)記，利用抗原或抗體進(jìn)行快速定量檢測(cè)。免疫法在檢測(cè)大腸桿菌方面主要方法有免疫磁珠法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫法等[14]。免疫法具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但待測(cè)物抗體的制備較為復(fù)雜。

酶底物法基于微生物代謝過程中產(chǎn)生的特異性酶可以專一地催化底物的原理對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，大腸桿菌較其他微生物特有的酶是β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，該酶通常作為大腸桿菌標(biāo)志酶[15]?；讦?D-葡萄糖醛酸糖苷酶檢測(cè)大腸桿菌的方法被廣泛應(yīng)用，也研究了多種可用于顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)的催化底物。雖然該方法在特異性方面有出色表現(xiàn)，但技術(shù)本身的局限性導(dǎo)致了其靈敏度不高。

電化學(xué)法是通過制備電化學(xué)生物傳感器，利用微生物的物理、化學(xué)或電學(xué)變化及獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析的研究方法。電化學(xué)檢測(cè)大腸桿菌的方法常分為3類：基于標(biāo)記的間接檢測(cè)方法、基于無標(biāo)記的直接檢測(cè)方法、基于微生物代謝的檢測(cè)方法。電化學(xué)方法得以廣泛研究應(yīng)用的主要原因在于其具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，且檢測(cè)范圍廣、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短，重要的是其可以通過與其他技術(shù)聯(lián)用以滿足不同的需求。

2 電化學(xué)生物傳感器技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 檢測(cè)原理

電化學(xué)檢測(cè)原理是復(fù)相化學(xué)反應(yīng)，一般反應(yīng)形式如公式（1）所示。

式中：O為化合物的氧化態(tài)，R為還原態(tài)，ne為氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)移的電子。電極表面反應(yīng)過程主要為：O從溶液中遷移至電極/溶液界面→O在電極表面吸附→O得電子還原為R→R從電極表面解析→R從電極/溶液界面遷移至溶液中，該過程為法拉第過程。電極表面的雙電層結(jié)構(gòu)（電極/溶液界面）相當(dāng)于一個(gè)電容器，其具有電容特性，當(dāng)電極電位改變時(shí)雙電層充電或放電，該過程電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電信號(hào)，通過對(duì)電信號(hào)的采集處理即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)。

穩(wěn)態(tài)測(cè)量技術(shù)：電化學(xué)穩(wěn)態(tài)是指電化學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)（如電極界面狀態(tài)、電流密度、電極電勢(shì)等）沒有變化或變化可忽略的狀態(tài)。穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的特點(diǎn)是穩(wěn)態(tài)電流全部用于電化學(xué)反應(yīng)，且電極界面上擴(kuò)散層范圍不變，擴(kuò)散層厚度恒定。穩(wěn)態(tài)法檢測(cè)的是電極過程達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后電流密度與電極電勢(shì)的關(guān)系，此時(shí)電流密度與電極電勢(shì)不隨時(shí)間改變，外電路即代表速率。Rocchini等[16-17]學(xué)者利用穩(wěn)態(tài)技術(shù)論述了極化曲線動(dòng)力學(xué)計(jì)算對(duì)掃描速率的影響。值得注意的是，在使用固體電極時(shí)，隨著測(cè)量時(shí)間的延長(zhǎng)，電極表面狀態(tài)及其表面積的變化情況逐漸累積，不可忽略。

暫態(tài)測(cè)量技術(shù)：暫態(tài)是當(dāng)系統(tǒng)極化條件改變時(shí)電極經(jīng)歷的一段不穩(wěn)定、變化的階段，是電極從一個(gè)穩(wěn)態(tài)向另一個(gè)穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡狀態(tài)。暫態(tài)過程具有雙電層充電電流，且電極附近液層中的電極電勢(shì)、雙電層結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散層厚度、濃度梯度等參數(shù)均隨時(shí)間變化。暫態(tài)法主要研究手段依據(jù)施加擾動(dòng)信號(hào)的大小分類，小幅度擾動(dòng)信號(hào)（濃差極化可忽略）采用等效電路研究，電極過程處于傳荷過程控制，大幅度擾動(dòng)信號(hào)（濃差極化不可忽略）采用方程解析法研究。暫態(tài)法主要可用于測(cè)量 i、k 等動(dòng)力學(xué)參數(shù)[18-20]，雙電層電容[21-22]、溶液電阻[23-25]等電化學(xué)參數(shù)，電沉積[26-27]、金屬腐蝕[28-29]等表面狀態(tài)變化快的體系。

2.2 技術(shù)分類

線性電勢(shì)掃描法，在電化學(xué)分析中又稱伏安法，是通過控制電極電勢(shì)以恒定速率變化來測(cè)量電極電流的方法，其中常用的檢測(cè)手段包括薄層伏安法、循環(huán)掃描法、循環(huán)伏安法等。一般情況下線性掃描有以下特點(diǎn)：測(cè)得的電流是電極雙電層充電電流和放電電流之和；由于電勢(shì)不斷變化，因此雙電層充電電流不為零；雙電層電容隨著電勢(shì)變化而改變；而電勢(shì)變化也導(dǎo)致反應(yīng)速率改變。特別的是，如果電極表面在電勢(shì)變化范圍內(nèi)不發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，則相當(dāng)于理想極化電極，測(cè)得曲線反映的即是雙電層電容和電勢(shì)的關(guān)系。

脈沖伏安法是通過消除充電電流進(jìn)行研究的一種極譜技術(shù)，其具有分辨率高、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn)。該技術(shù)方法被廣泛應(yīng)用于痕量分析[30-32]的原因是其通過充分減少充電電流和毛細(xì)管噪聲電流，提高了信噪比，使其達(dá)到極高的靈敏度。脈沖技術(shù)又可細(xì)分為常規(guī)脈沖伏安法、微分脈沖伏安法、差示脈沖伏安法、方波伏安法等，其中差示脈沖伏安法和方波伏安法是靈敏度最高的檢測(cè)方法。

電化學(xué)阻抗法是屬于暫態(tài)電化學(xué)技術(shù)的一類檢測(cè)方法，其原理也是向電化學(xué)系統(tǒng)施加一個(gè)擾動(dòng)信號(hào)，通過觀測(cè)系統(tǒng)電信號(hào)響應(yīng)分析系統(tǒng)電化學(xué)性質(zhì)，特別的是其施加的電信號(hào)是不同頻率的振幅較小的正弦電勢(shì)波，測(cè)量的信號(hào)是電勢(shì)與電流信號(hào)的比值（即阻抗）。由于電化學(xué)阻抗法向電極施加的是小振幅交流電信號(hào)，因此當(dāng)頻率足夠高時(shí)其表面狀態(tài)化和濃差極化不至太嚴(yán)重，且不會(huì)導(dǎo)致極化累積，避免了對(duì)電化學(xué)體系產(chǎn)生過大的影響。

3 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌的進(jìn)展

電化學(xué)生物傳感器用于直接檢測(cè)大腸桿菌的技術(shù)根據(jù)制造傳感器的檢測(cè)策略分為依賴標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)和無標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，其中依賴標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器采用間接檢測(cè)法，一般情況下采用生物分子或其他理化分子（如酶、金屬納米顆粒等）對(duì)目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記，用于誘導(dǎo)電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。而無標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)是在電極表面固定生物受體（如抗體、核酸等）用于特異性識(shí)別，在不進(jìn)行標(biāo)記的條件下，通過細(xì)菌的附著引起電化學(xué)參數(shù)變化，從而直接檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌。除上述兩種直接檢測(cè)大腸桿菌的技術(shù)外，還有一種采用通過對(duì)大腸桿菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析從而間接檢測(cè)大腸桿菌的技術(shù)，即基于微生物代謝的檢測(cè)技術(shù)。

3.1 基于標(biāo)記的間接檢測(cè)傳感器

Gehring等[33]基于酶聯(lián)免疫法制備了酶聯(lián)免疫磁電化學(xué)生物傳感器，將大腸桿菌固定在免疫磁珠和酶結(jié)合抗體之間制成三明治結(jié)構(gòu)，多孔板磁化石墨電極用于吸附被捕獲的大腸桿菌，該傳感器在緩沖溶液中檢測(cè)限為3.3×103cfu/mL。由于傳感器檢測(cè)的電信號(hào)是由標(biāo)簽轉(zhuǎn)換而來，則還有一種檢測(cè)思路是采用多個(gè)不同的標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)細(xì)菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。Viswanathan等[34]制備了一種可以同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌、沙門氏菌和彎曲桿菌的傳感器，他們將這3種細(xì)菌分別用 Cd、Cu、Pb 標(biāo)簽標(biāo)記為 E.coli-CdS、Salmonella-CuS、Campylobacter-PbS，并將這3種細(xì)菌的抗體功能化多壁碳納米管-聚烯丙基胺修飾到絲網(wǎng)印刷電極表面，被標(biāo)記的細(xì)菌被捕獲后與特定的抗體結(jié)合并釋放標(biāo)記物金屬離子，通過對(duì)不同金屬離子的測(cè)定實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌的定量檢測(cè)，3種細(xì)菌檢測(cè)限分別為0.8×103、0.4×103、0.4×103cfu/mL。

基于標(biāo)記的電化學(xué)傳感器優(yōu)勢(shì)在于其通過標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了對(duì)電信號(hào)的放大，從而降低了檢測(cè)限、提高了特異性。但是，這類電化學(xué)傳感器由于標(biāo)記過程的復(fù)雜性而延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間、增加操作難度。

3.2 基于無標(biāo)記的直接檢測(cè)傳感器

根據(jù)Wang等[35]的報(bào)道，天然細(xì)菌細(xì)胞膜厚度為5 nm～10 nm，因?yàn)槟さ倪x擇透過性所以細(xì)菌電阻為102Ωcm2～105Ωcm2，電容為 0.5 μF/cm2～1.3 μF/cm2，因此細(xì)菌在電極表面的附著可以引起電化學(xué)參數(shù)的變化。Zelada-Guillén等[36]制備了一種簡(jiǎn)單直接有效的傳感器用于檢測(cè)大腸桿菌，該傳感器通過在修飾有單壁碳納米管的玻碳電極表面固定適配子實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的特異性檢測(cè)，經(jīng)過對(duì)食品樣液預(yù)處理后，該傳感器在牛奶中檢測(cè)限達(dá)到6 cfu/mL，在蘋果汁中達(dá)到26 cfu/mL。Li等[37]利用石英晶金電極制備了一種免疫傳感器，該傳感器先用蛋白A對(duì)電極進(jìn)行簡(jiǎn)單修飾，然后用抗大腸桿菌抗體進(jìn)行功能化，由于該傳感器的電極表面積較大，從而可以捕獲更多細(xì)菌，增大了電阻變化，該傳感器檢測(cè)限為103cfu/mL。

相較于基于標(biāo)記的電化學(xué)傳感器，無標(biāo)記電化學(xué)傳感器最大的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)過程簡(jiǎn)單，但是也存在檢測(cè)限不夠低、靈敏度不夠高、電極再生困難等不足。

3.3 基于微生物代謝的檢測(cè)傳感器

活的微生物在生長(zhǎng)代謝過程中加入某些特定介質(zhì)后，能通過代謝時(shí)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)，目前該技術(shù)主要基于傳感器上的pH值、離子濃度、電阻等電化學(xué)參數(shù)的變化對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，多年來，依據(jù)對(duì)微生物代謝過程進(jìn)行檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的傳感器已不在少數(shù)[38-39]。

Sippy等[40]依據(jù)大腸桿菌在代謝過程中能產(chǎn)生分解過氧化氫的過氧化氫酶[41]的原理，通過檢測(cè)大腸桿菌代謝消耗的過氧化氫的量實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)，該傳感器檢測(cè)范圍為20cfu/mL～2.0×107cfu/mL。程欲曉[10]通過對(duì)大腸桿菌溶液進(jìn)行預(yù)處理，使代謝產(chǎn)物β-D-半乳糖苷酶釋放到溶液中，再向溶液添加底物氨基酚-β-D半乳糖苷酶，利用代謝產(chǎn)物水解底物產(chǎn)生對(duì)氨基酚的反應(yīng)，制備了大腸桿菌電化學(xué)傳感器，傳感器檢測(cè)范圍為50 cfu/mL～1.0×105cfu/mL。

基于微生物代謝的檢測(cè)傳感器在檢測(cè)大腸桿菌方面具有方便快捷的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但仍存在特異性不高、靈敏度低等不足。

4 展望

由于大腸桿菌作為重要的環(huán)境監(jiān)測(cè)指標(biāo)且其在食品領(lǐng)域零容忍的政策，因此對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)有著較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，在電化學(xué)生物傳感器方面也有靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、檢測(cè)時(shí)間等指標(biāo)的要求。近年來，隨著納米技術(shù)、小型芯片技術(shù)、絲網(wǎng)印刷技術(shù)在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，電化學(xué)生物傳感器也得到了迅速的發(fā)展，且逐漸被認(rèn)為是微生物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)最具前景的檢測(cè)方法。電化學(xué)生物傳感器雖然有小型化、成本低、受樣品影響小等優(yōu)勢(shì)，但在穩(wěn)定性、易保存性、可再生性及批量生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)商品化方面仍有較大發(fā)展空間，而且目前尚缺少對(duì)于電化學(xué)生物傳感器的官方統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)生物傳感器商業(yè)化仍任重道遠(yuǎn)。