甘麥鄰，劉 麟，鄭 婷，趙 雪，郭宗義，沈林園，潘紅梅，張 亮，王金勇*，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，四川成都 611130；3.重慶市畜牧科學院，重慶 402460）

養(yǎng)豬業(yè)是我國畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，長期以來我國的生豬飼養(yǎng)量和豬肉消費量均是世界第一[1-2]。近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展和種豬聯(lián)合育種工作的需要，豬的人工授精技術快速發(fā)展和迅速普及[3]。此外，“非洲豬瘟”疫情仍在持續(xù)，豬精液的冷凍保存作為一種重要遺傳資源保存手段，可以對瀕危地方豬資源和優(yōu)秀公豬資源進行有效保存[4]。在豬精液保存過程中，精子活率容易受到各種因素的影響[5]。精液中的脂類物質(zhì)主要來源于前列腺，正常情況下可作為精子能量的儲存庫[6]。甘油三酯（TG）是精液脂類中的重要成分之一[7]，在人類[8]和動物生殖領域的研究發(fā)現(xiàn)TG 含量與精液量、精子活率和生殖道感染等指標密切相關[9]。

豬精液由于脂質(zhì)含量和組分特征與其他哺乳動物相差較大，導致其對低溫特別敏感，相關長期保存技術仍不成熟[10]。本實驗旨在探究豬精液中TG 含量對豬精液常溫和冷凍保存的影響，以期為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 12 頭3～5 歲大白公豬來自四川某公豬站，飼養(yǎng)管理一致，采精頻率每周2次。常溫稀釋液（AndroPRO Plus），冷凍基礎液（Androhep?CryoGuard Cooling &Freezing Extender）和解凍液（Androhep?CryoGuard Thaw Extender）（Minitube，德國）、新鮮雞蛋、甘油（索萊寶科技有限公司，北京）、0.25 mL 細管（IMV，法國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 常溫保存 選取同一采精人員同一天采精的9 頭公豬，每個樣本3 個重復。采精后取中段精液經(jīng)紗布過濾后，在無菌、避光條件下使用專用精液稀釋液1:2 稀釋，置于17℃保溫箱保存。分別于保存0、24、48、96、144 h 檢測精子保存效果。

1.2.2 計算凍精總量 精子總數(shù)=精液密度×精液量。本研究擬設計冷凍精液密度為4 億/mL，因此凍精總量=總精子數(shù)÷4 億/mL，并以此計算后續(xù)冷凍稀釋液各組分的用量。

1.2.3 冷凍保存 將17℃恒溫保存過夜的稀釋精液，在預冷好的17℃離心機中2 300 ×g 離心5 min，棄上清；沉淀按8 億/mL 的濃度加入冷凍稀釋液Ⅰ（冷凍基礎液:新鮮蛋黃=4:1），吹勻后置于4℃平衡2.5 h；平衡結束后按1:1 比例加入冷凍稀釋液II（冷凍稀釋液I 加入終濃度6%的甘油，提前預冷到4℃），待加入II 液后45 min 左右開始液氮熏蒸；精液細管在距液氮液面高度5 cm 左右（溫度-80～-120℃）熏蒸8 min 后投入液氮，冷凍精液細管分別裝入標記好的拇指管和布袋中置于液氮罐保存?zhèn)溆?；解凍時從液氮中取出細管，以42℃水浴16 s 的解凍方式進行解凍，然后以1:9 加入解凍液，37℃孵育10 min 檢測活率。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 生化指標檢測 取中段精液稀釋前的原精，在17℃環(huán)境3 000 ×g 離心5 min，取精漿，檢測TG、過氧化氫（H2O2）、總抗氧化能力（T-Aoc）、果糖（Fructose）、鋅（Zn）、總蛋白（TP）、總氨基酸（TAA）、白蛋白（ALB）含量和酸性磷酸酶（ACP）活性，檢測試劑盒均使用索萊寶公司（北京）生產(chǎn)試劑盒，按照說明書進行操作。

1.3.2 精液質(zhì)量檢測 將豬專用精子計數(shù)板置于37℃載物臺預熱，再將精液樣品緩慢注入計數(shù)待檢計數(shù)室，使之均勻流入整個計數(shù)室，再在顯微鏡下觀察并使用精子自動分析系統(tǒng)（AndroVision，Minitube，德國）分析精子活率、活力、快速前進運動精子數(shù)和慢速運動精子數(shù)。常溫保存時間從稀釋穩(wěn)定后開始算起；冷凍保存時間從完成冷凍操作后投入液氮中開始算起。

1.4 統(tǒng)計分析 精子計數(shù)和分析系統(tǒng)使用AndroVision。所有結果均表示為“平均值± 標準差”。運用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行相關性分析和單因素方差分析，顯著性檢驗采用T 檢驗方法。P＜0.05 時記為顯著，P＜0.1時記為存在趨勢。

2 結果

2.1 不同保存方法對豬精子活率、活力和運動指標的影響 如圖1 所示，常溫稀釋的精液在17℃恒溫保存，精子活率、活力、快速前進運動精子和慢速前進運動精子均隨時間推移而下降，至144 h 時精子活率、活力和慢速前進運動精子比例均低于0 h（P＜0.05），但144 h時仍有66.6%的活率和50.22%的活力，依舊維持在較高水平。而冷凍保存精子在42℃，16 s 條件下解凍后活率為45.46%，活力為34.99%，低于常溫保存的各個時間段組（P＜0.05）。

圖1 豬精液不同保存方式精子指標變化

2.2 精漿TG 含量與豬精液保存指標的相關性分析 本研究中豬精漿TG 含量平均值為（0.66±0.30）mmol/L（最小值0.23 mmol/L，最大值1.00 mmol/L）。從表1可以看出，精漿中TG 含量與稀釋保存0 h 和144 h 后的精子活率、活力、快速前進運動精子和慢速前進運動精子均不相關（P＞0.05），但精漿中TG 含量與豬精液冷凍保存后的活率顯著負相關（P＜0.05），精漿TG 含量與冷凍保存后的精子活力、快速前進運動精子和慢速前進運動精子存在負相關的趨勢（P＜0.1）。

表1 精液TG 含量與豬精子指標的相關性分析 %

2.3 精漿中高、低TG 的生化指標分析 為進一步分析精漿TG 水平對豬精液保存效果的影響，選取相近日齡的大白公豬6 頭，其中精漿高TG 和低TG 公豬各3 頭（圖2-A），兩組的TG 含量相差3.18 倍，在同一天采集精液，檢測發(fā)現(xiàn)高TG 組精漿中果糖、H2O2、TP 含量顯著或極顯著高于低TG 組，ALB 也存在相同趨勢（P＜0.1），其余生化指標無顯著差異。

圖2 豬精漿不同TG 含量對精漿生化指標的影響

2.4 精漿高TG 組和低TG 組不同保存方式下精子指標差異 如圖3 所示，精液稀釋并在17℃恒溫箱中緩慢降溫至17℃穩(wěn)定后立即檢測，發(fā)現(xiàn)精漿高TG 組的精子活力高于低TG 組（P＜0.05），精子活率、快速前進運動精子和慢速前進運動精子均無顯著差異。17℃保存144 h 后，高TG 組與低TG 組各項指標均無顯著差異。液氮冷凍保存后，高TG 組精子活力和快速前進運動精子與低TG 組無顯著差異，但高TG 組精子活率低于低TG 組（P＜0.05），且慢速運動精子數(shù)與低TG 組相比有降低趨勢（P＜0.1）。

圖3 豬精漿不同TG 含量對不同保存方式精子指標的影響

精漿高TG 組和低TG 組精液在常溫保存0 h 和144 h 及冷凍-解凍后測得H2O2含量均無顯著差異，但常溫保存144 h 與0 h 相比，精漿高TG 組精液H2O2含量上升4.50 倍，而精漿低TG 組精液H2O2含量僅較0 h上升2.37 倍。

冷凍-解凍精液檢測結果表明，高TG 組精子活率、活力下降均超過50%，高于低TG 組（P＜0.01）。兩組間快速前進運動精子和慢速前進運動精子下降比率未達顯著水平。

3 討 論

3.1 精漿TG 含量對豬精液常溫保存的影響 豬精液常溫保存技術目前應用較為普及[11]，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中被大面積推廣使用，大多數(shù)常溫保存技術可以有效保存3～5 d[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，常溫保存3～5 d 對精子活率和活力無顯著影響，在保存144 h（7 d）后精子活率和活力才顯著下降。

動物精子與精囊腺、前列腺和附睪的分泌物共同構成精液。精漿中的脂類主要來源于前列腺，其功能是作為精子的能量物質(zhì)。在人醫(yī)臨床檢測中，TG 含量的高低常被用于輔助鑒別前列腺異常[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，精漿中TG 含量與稀釋保存0 h 和144 h 后的精子活率、活力、快速前進運動精子和慢速前進運動精子均不相關。精漿果糖是精囊腺功能的特征性標記物，也是精子能量代謝的重要來源，經(jīng)糖酵解和線粒體呼吸作用產(chǎn)生的ATP 為精子供能[14]。精液中活性氧（ROS）作為生理過程中信號傳導元素，在精子獲能中起重要作用，適量的ROS 是調(diào)節(jié)正常精子功能（如精子獲能、精卵融合等）所必需的，起到介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)磷酸化等重要生理生化功能[15]，但過量的ROS 會引起精子質(zhì)膜、DNA 損傷，導致精液質(zhì)量下降，H2O2是精液中ROS 的重要組成成分[16]。研究發(fā)現(xiàn)，精漿蛋白與男性生育力息息相關，它可以影響精子的成熟、獲能、受精并反映前列腺、精囊腺的功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高TG 組精漿中果糖、H2O2、TP 含量顯著高于低TG 組，且高TG 組原精中精子活力顯著高于低TG 組，可能是高TG 組精液的果糖和蛋白等能量物質(zhì)較豐富，而短時間內(nèi)H2O2未對精子造成損傷。

圖4 豬精漿不同TG 含量對不同保存方式精液H2O2 含量的影響

圖5 豬精液冷凍保存后精子指標下降比率

在常溫（17℃）保存豬精液時通常不會去除精漿[18]，此外，常規(guī)離心并不能完全去除精漿，且副性腺分泌物在體內(nèi)對精子已經(jīng)產(chǎn)生了影響，豬精液保存過程中精漿分泌物對精子的作用還會產(chǎn)生持續(xù)影響。精漿中的脂類物質(zhì)在保存過程中會發(fā)生氧化，而精漿中的過氧化氫也會進一步加劇氧化過程，產(chǎn)生大量ROS[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在精漿中高TG 組精子活力顯著高于低TG 組，且精子活率、快速前進運動精子和慢速前進運動精子均略高于低TG 組。但隨著保存時間的延長，各項精子指標變化不大，僅精子活率和慢速前進運動精子數(shù)略低于低TG 組。此外，17℃保存144 h 后檢測結果表明，高TG 組精液H2O2含量較保存0 h 上升4.50 倍，而低TG組精液H2O2含量僅上升2.37 倍。可以預見，隨著常溫保存時間的進一步延長，高TG 組精液質(zhì)量下降的速度高于低TG 組。

3.2 精漿TG 含量對豬精液冷凍保存的影響 由于豬精液中精子密度較低，且豬精子質(zhì)膜結構和組分特征與其他哺乳動物存在較大差異[20]。長期以來，豬精液的冷凍保存和推廣使用一直未取得突破性進展。精液中的副性腺分泌物通常能為精子提供能量和保護，但這些精漿組分是否會對精液冷凍后的精子質(zhì)量造成影響還知之甚少。

豬精液冷凍保存和復蘇，經(jīng)歷了從液態(tài)—固態(tài)—液態(tài)的變化，因此初始的精子損害會被進一步放大[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，精漿TG 含量與精液冷凍復蘇后的精子活率呈顯著負相關。盡管新鮮精液中高TG 組具有更高的活力，但凍存后其活力顯著下降，慢速前進運動精子數(shù)也有下降趨勢，且高TG 組精液凍存后的精子活率和活力下降比例也顯著高于低TG 組。由于豬精液冷凍保存會以離心方式去除精漿，一方面在離心之前精漿脂質(zhì)已經(jīng)對精子造成損害，另一方面精子表面可能附著了脂質(zhì)成分，對保存過程的精子造成了持續(xù)傷害。

精漿成分主要是副性腺的分泌物，而這些分泌過程受生理、營養(yǎng)和管理等因素的影響，因此可通過相應的營養(yǎng)和管理手段達到適當調(diào)節(jié)的目的[22]。由于常溫保存和冷凍保存均與豬直接交配的生理過程和環(huán)境不同，因此推測常溫短期保存可不必考慮精漿TG 水平，而常溫長期保存和冷凍保存應在優(yōu)先考慮新鮮精液質(zhì)量的基礎上，通過檢測精漿TG 含量，選擇低TG 水平的精液用于保存。目前，關于影響豬精漿TG 含量的環(huán)境和遺傳因素的研究報道均比較缺乏，還有待于進一步探究。在后續(xù)研究中可通過干預影響豬精漿TG 含量的因素，進一步調(diào)控豬精漿TG 水平，以利于豬精液的長期保存。

4 結 論

本研究結果表明，精漿TG 水平對豬精液冷凍保存存在不利影響，而對常溫保存精液影響較小。在豬精液的常溫保存過程中可以不必考慮精漿TG 水平，而冷凍保存時選擇精子活力和活率高且TG 含量較低的精液可以取得更好的保存效果。豬精漿TG 水平可以作為一個預估豬精液冷凍價值的潛在指標，但其作用機制和內(nèi)在規(guī)律還有待于在大樣本和分子及超微結構層次做更深入研究。