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        睡眠剝奪后大鼠下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達及其對學習記憶的影響*

        2021-06-18 06:12:14倪麗艷唐吉友
        關鍵詞:下丘腦象限迷宮

        倪麗艷 唐吉友

        1.巨野縣人民醫(yī)院,山東 巨野 274900; 2.山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014

        睡眠剝奪(sleep deprivation,SD)指由于環(huán)境或自身原因導致沒有充足睡眠的一種狀態(tài),是現(xiàn)代社會的普遍現(xiàn)象。研究表明SD會降低人及實驗動物的學習能力并損害記憶[1-3]。然而導致SD損害學習記憶的機制目前尚不完全清楚。Orexin-A是下丘腦外側區(qū)分泌的一種神經(jīng)肽,Orexin-A的重要作用是調節(jié)睡眠/覺醒[4],睡眠剝奪可激活Orexin神經(jīng)元[3,5],正是由于Orexin的發(fā)現(xiàn),失眠的概念由睡眠失調轉為過度覺醒[6]。另有研究表明,Orexin-A與學習記憶密切相關[7]。

        為進一步探討下丘腦Orexin-A的變化在睡眠剝奪影響學習記憶中的作用,本研究中使用跑步機剝奪睡眠的方法使大鼠的非快速眼球運動(non-rapid eyes movement,NREM)和快速眼球運動(rapid eyes movement,REM)睡眠減少[8],觀察下丘腦Orexin-A的表達,并利用Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1動物及分組

        健康成年雄性 Wistar大鼠,質量(200±20)g,由山東濟南朋悅實驗動物有限公司提供。隨機分為空白對照(CC)組、環(huán)境對照(TC)組、睡眠剝奪(SD)組。大鼠均在12 h光亮/黑暗條件、22~25 ℃環(huán)境溫度下分籠喂養(yǎng)。

        1.1.2主要試劑與儀器

        水迷宮設備(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司);跑步機(ZH-PT型多功能跑臺系統(tǒng),安徽正華生物儀器設備有限公司);顯微鏡(OLYMPUS,日本)。兔抗 Orexin-A多克隆抗體(Cell Signaling Technology,CST),山羊抗兔IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

        1.2 試驗方法

        1.2.1睡眠剝奪

        采用間歇式跑步機系統(tǒng)對大鼠進行72 h全睡眠剝奪,跑步機的傳送帶上方0.6 cm處為有機玻璃分隔成大小相等的鼠籠(28 cm×28 cm×40 cm),籠頂扣上柵欄式鼠籠蓋,可放置飼料和水瓶,跑步機的傳送帶形成鼠籠的底。當大鼠在跑步機上時,可以自由獲取食物和水。動物房光照/黑暗周期為12 h∶12 h,光照時間為8:00~20:00,動物房溫度22~24℃,濕度60%~70%,避免噪音。跑步機速度設定為10 cm/s。SD組設定運行3 s,停止12 s;TC組設定運行15 min,停止60 min,允許TC組大鼠獲得持續(xù)的休息時間,但跑步的總距離相等。運行和停止循環(huán)進行。

        1.2.2Morris水迷宮試驗

        采用Morris水迷宮(MWM)檢測SD后大鼠的空間學習記憶功能。水迷宮裝置由一個直徑150 cm、深80 cm的圓形水池組成,分為4個大小相等的象限;池內水深40 cm,水溫(24±1)℃;水面以上每個象限池壁中心位置處各張貼1個不相同的醒目標記。水面下1 cm隱藏著一個直徑10 cm的黑色圓形平臺,該平臺的位置在整個試驗過程中保持不變。

        1.2.2.1定位航行試驗 測試大鼠對水迷宮的學習能力。根據(jù)水池中每個象限的標記,訓練大鼠尋找隱藏在水面下的平臺。選擇每個象限的醒目標記下方為入水點,將大鼠面向池壁放入水中。象限選擇是隨機的,每個象限都有1次機會。每次實驗時,將一只大鼠放入水池中,允許其在水下搜索平臺的最長時間為120 s,大鼠發(fā)現(xiàn)平臺后允許其在平臺上停留30 s。如果在120 s內未能找到平臺,則將其引至平臺,記錄其逃避潛伏期為120 s。4個象限的平均逃避潛伏期為大鼠學習能力的每日結果。

        1.2.2.2空間搜索試驗 測試大鼠對平臺空間位置的記憶能力。在訓練后第6天進行,測試只進行1次,測試時間為120 s。將隱藏的平臺從水迷宮中移走,選平臺相對象限為入水點。記錄每只大鼠的目標象限停留時間和穿越原平臺位置次數(shù)。

        1.2.3免疫組化

        睡眠剝奪后3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,沿腹中線剪開胸骨,暴露心臟,用16號針頭穿刺通過左心室至升主動脈,大彎鉗夾住針頭固定,再用剪刀剪破右心耳,先用0.9%生理鹽水快速沖洗,直至流出的液體為無色透明的澄清液,再灌注含4%多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4),斷頭取腦后在10%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋、切片。組織切片預處理后行抗原修復,3%H2O2去離子水孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶,PBS沖洗5 min×3次,加兔抗 Orexin-A多克隆抗體 (1∶1000, CST),4 ℃過夜,PBS沖洗5 min×3次,加生物素標記的山羊抗兔IgG,37 ℃孵育20 min,PBS沖洗5 min×3次,加生物素-卵白素-HRP復合物ABC,37 ℃孵育20 min,PBS沖洗5 min×3次,DAB顯色,自來水沖洗,蘇木精復染,脫水、透明、封片,脫蠟水化組織切片,甘油封片,顯維鏡下觀察。

        1.3 統(tǒng)計學處理

        2 結 果

        2.1 大鼠下丘腦Orexin-A陽性神經(jīng)元表達

        2.1.1Orexin-A神經(jīng)元形態(tài)

        在光鏡下觀察到大鼠下丘腦外側區(qū)大量胞質染成棕黑色的細胞,為Orexin-A神經(jīng)元的陽性表達。SD組大鼠的Orexin-A神經(jīng)元的細胞大小、著色深度及細胞核大小與 CC組相比未見明顯差異,見圖1。

        圖1 下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達(A為CC組;B為TC組;C為SD組)

        2.1.2下丘腦Orexin-A神經(jīng)元數(shù)量

        SD、CC及TC組大鼠下丘腦Orexin-A陽性細胞數(shù)分別為623.00±7.54129、426.40±31.16569、457.00±4.73254,SD組較CC及TC組明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖2。

        圖2 大鼠下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達數(shù)量比較(與TC和CC組比較,*P<0.001 )

        2.2 Morris水迷宮檢測結果

        2.2.1定位航行試驗結果

        SD結束后行水迷宮試驗檢測各組大鼠的學習能力,隨著訓練天數(shù)增加,各組大鼠的逃避潛伏期逐漸縮短。SD組大鼠同一天的逃避潛伏期與CC組和TC組相比延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1,圖3。

        表1 各組大鼠平均逃避潛伏期比較

        圖3 各組大鼠平均逃避潛伏期比較(與CC和TC組比較,*P<0.01)

        2.2.2空間搜索試驗結果

        CC、TC和SD組大鼠穿越平臺象限次數(shù)分別為(22.0625±2.86284)、(22.1875±2.53558)和(12.8750±2.30579)次,平臺所在象限游泳時間分別為(54.5169±3.88937)、(54.3131±3.24989)和(46.3781±4.11376)s, 與TC和CC組相比,SD組穿越平臺象限次數(shù)和平臺所在象限游泳時間減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖4,5。

        圖4 各組大鼠穿越平臺次數(shù)(與CC和TC組比較,*P<0.01)

        圖5 各組大鼠平臺象限的停留時間(與CC組和TC組比較,*P<0.01)

        3 討 論

        有研究表明,SD導致實驗動物學習記憶能力下降,表現(xiàn)為一些行為學任務下降,如Morris水迷宮任務[3]、逃避任務[9]、徑向水迷宮任務[10]等。本研究結果表明,在Morris水迷宮測試中,72 h SD的大鼠逃避潛伏期延長,平臺穿越次數(shù)及目標象限停留時間減少,提示72 h SD損害Morris水迷宮試驗中大鼠的空間學習記憶能力。我們的研究結果還表明,72 h SD后大鼠下丘腦外側區(qū)Orexin A分泌增多,同時伴隨Morris水迷宮空間學習記憶能力的損害。我們推測下丘腦Orexin A的過度表達可能在睡眠剝奪影響海馬依賴性空間學習和記憶中發(fā)揮重要作用。

        Orexin,又稱hypocretin,是由下丘腦外側區(qū)的Orexin前體產(chǎn)生的一種神經(jīng)肽,包括Orexin A和Orexin B,其中Orexin A的生物活性相對穩(wěn)定,其通過激活兩個G-蛋白耦聯(lián)受體Orexin-1受體(OX1)和 Orexin-2受體(OX2)發(fā)揮其生物學作用[11]。近年來研究表明,Orexin及其受體不僅參與睡眠/覺醒狀態(tài)的調節(jié)[12-13],還與學習記憶密切相關[14-17]。Orexin在調節(jié)睡眠和覺醒中的作用的研究較多,有研究顯示Orexin缺乏可導致猝倒型發(fā)作性睡病(以過度嗜睡、睡眠發(fā)作、猝倒發(fā)作和睡眠片段化為主要表現(xiàn))[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)患者維持覺醒狀態(tài)時Orexin神經(jīng)元放電,睡眠時(包括NREM和REM期)停止放電[19]。REM期SD激活Orexin神經(jīng)元,導致Orexin合成/釋放增加,Orexin受體表達增加[20-21]。Orexin對學習記憶的影響研究觀點不完全一致。Aou等[16]的研究表明,Orexin-A通過影響海馬CA1突觸的長時程增強抑制損害空間記憶能力。Akbari等[22]的研究則發(fā)現(xiàn),海馬CA1注射Orexin-1受體拮抗劑損害Morris水迷宮任務中的記憶的存儲、鞏固和提取,似乎提示內源性Orexin-A促進大鼠的空間學習和記憶。Akbari等[23]的另一項試驗發(fā)現(xiàn)CA1區(qū)或DG區(qū)注射Orexin-1受體拮抗劑后記憶受損,進一步證實內源性Orexin-A在學習中發(fā)揮重要作用,也提示Orexin-1受體在大鼠空間學習和記憶中發(fā)揮重要作用。另外某些病理情況下注射Orexin-A可改善記憶,如海馬內注射Orexin-A可減輕辣椒素治療引起的學習記憶障礙[24]。臨床上Orexin受體拮抗劑Belsomra (suvorexant)已被FDA批準用于治療失眠[25],研究表明治療范圍內的Orexin受體拮抗劑DORAs促進睡眠且不影響認知功能[26]。我們推測體內Orexin A維持動態(tài)平衡,Orexin A不足或過度增多都可能導致空間學習記憶障礙。

        綜上,睡眠剝奪損害大鼠空間學習記憶能力的機制可能與下丘腦Orexin A的過度表達有一定關系。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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