郝 瑞 許雙雙 高 敏 王燕華 呂玉芹 王 娜 張敬軍

1. 山東省泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000； 2.山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000

大動脈粥樣硬化性 (large-artery atherosclerosis, LAA) 腦梗死發(fā)病機制尚未闡明，部分LAA腦梗死患者具有家族聚集性[1-3]。部分LAA腦梗死患者對氯吡格雷療效存在明顯個體差異,這些現(xiàn)象的發(fā)生機制尚未完全闡明，推測可能與ADP、CYP2C19、P2Y12及GPⅡb/Ⅲa等基因多態(tài)性有關[2]，關于這些基因是否參與LAA腦梗死形成發(fā)病機制研究報道較少。本研究探討家族聚集性LAA腦梗死、散發(fā)性LAA腦梗死及對照組ADP蛋白表達、CYP2C19基因、P2Y12基因G52T位點及GPⅡb/Ⅲa蛋白表達差異，為LAA腦梗死發(fā)病機制及分層防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象

1.1.1分組 分別選擇25例(中國北方漢族)三甲醫(yī)院神經(jīng)內科住院家族聚集性LAA腦梗死患者(經(jīng)CT或MRI 證實)及散發(fā)性LAA腦梗死患者為家族組及散發(fā)組。按照家族聚集性LAA腦梗死及散發(fā)性LAA腦梗死的診斷標準嚴格入選所有患者。選擇25例與LAA腦梗死患者同期就診于同一醫(yī)院其他科室的非心腦血管病患者為對照組，要求與先證者同性別、同民族、年齡相差不超過5 歲。使用NIHSS評分量表對入院患者行NIHSS評分(總分為0～42分)，分數(shù)越高說明神經(jīng)功能缺損程度越重。常規(guī)治療3個月后隨訪其神經(jīng)功能恢復情況，用mRS評分量表進行評分,分數(shù)越高說明神經(jīng)功能恢復程度越差。3組研究對象一般臨床資料見表1。

1.1.2納入標準 腦梗死和LAA腦梗死診斷標準參照文獻[4]；家族聚集性LAA腦梗死診斷標準參照文獻[3]。

1.1.3排除標準 排除心源性栓塞所致腦梗死，如在狹窄>50%或閉塞顱內或顱外大動脈支配區(qū)之外無急性梗死灶，沒有心源性卒中中度或高度危險因素。最近有顱腦損傷、腫瘤、手術、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病及嚴重心、肺、腎等疾?。挥袊乐馗文I疾病、血液疾病及自身免疫性疾病。

該研究得到山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本處理 所有入選患者在清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血2 mL(EDTA采血管)，采血后輕晃搖勻抗凝管，2 h內將抗凝管放置在-80 ℃的冰箱中。ELISA血液檢測要求：將收集到的抗凝血液加入淋巴細胞分離液，2500 r/min離心10 min，收集分離后的上清液，-80 ℃的冰箱中保存。

1.2.2qPCR表達實驗操作步驟 (1)從血液中抽提總RNA：將冰凍血液樣品復溫至常溫狀態(tài)，用力搖晃混合均勻，放置5 min，將血液樣本轉移至1.5 mL尖底離心管，常溫狀態(tài)下12 000 r/min離心2 min，丟棄上清液，反復離心處理完固定液，將0.75 mL去離子水加入固定液中，用槍頭吹打沉淀物；同樣條件下離心2 min，棄上清，將離心管扣在吸水紙上1 min。加入100 μL Buffer BR2，反復吹打10次懸浮沉淀物。釋放RNA，加入300 μL Buffer BR3，用力搖晃3次，室溫放置10 min。將所得產(chǎn)物轉入DNA吸附柱-RD，常溫狀態(tài)下8000 r/min離心30 s后轉入收集管，進行RNA提??；RNA洗脫：將吸附柱-A轉入試劑盒原本的1.5 mL離心管內，在硅膠膜中央加15 μL ddH2O，把1.5 mL離心管蓋(A)反置于RNA吸附柱上，做好標記，去除RNA吸附柱的蓋子(B)。常溫狀態(tài)下12 000 r/min離心1 min。(2)RNA反轉錄成cDNA：在RNase-Free的PCR管中加入RNA 1 μg，DEPC·H2O補足11 μL，搖晃均勻，65 ℃條件下孵育5 min，立即冰??；再依次加入5×reaction buffer 4.1 μL、RiboLockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μL) 0.6 μL、dNTP mix (10 mM) 2.1 μL、Reverse Tra Ace 1.1 μL、Oligo(dT) primer (0.5 μg/μL) 1.1 μL，42 ℃孵育60 min后，72 ℃孵育10 min。所得cDNA置于-20 ℃或即刻PCR。(3)qPCR引物設計：根據(jù)目的基因排列順序設計并合成qPCR檢測引物(表2)。(4)RT-PCR預實驗：利用mRNA逆轉錄產(chǎn)生cDNA作為PCR擴增模板，用目的基因特異性引物和內參引物擴增待檢測的目的基因片段和看家基因，探索最佳qPCR上機數(shù)值，若有雜帶再次調整PCR擴增時的退火溫度，直至雜帶消失。(5)qPCR正式實驗：在RT-PCR預實驗找出最適合引物退火溫度和模板量，運用2×SYBR Green Mix配置qPCR Mix，根據(jù)需要上機的樣品數(shù)量和重復次數(shù)，計算并配置qPCR Mix。將配置好的MIX分別置于AXYGEN PCR 8連管內，微型離心機瞬時離心混勻PCR體系；將以上實驗體系放到熒光定量PCR儀中，SYBR Green法熒光定量PCR以檢測各基因的表達量。

表2 RT-RCR檢測引物信息

1.2.3數(shù)據(jù)分析 由于RNA提純后獲得率不一致、RNA逆轉錄為cDNA的效率有差異等原因，為了校正因樣品開始時濃度差異對實驗結果的影響，在進行目的基因數(shù)量檢測時加入看家基因進行標準化。用△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

1.2.4蛋白含量測定 采用ELISA法，標準品與樣品中的待檢測因子與單抗結合，加入酶標抗體，形成免疫復合物連接在板上，加入酶底物TMB，測定450 nm處的OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 3組研究對象ADP 表達量

用ELASA法檢測ADP表達量，結果顯示ADP在家族組高表達，散發(fā)組中表達，對照組低表達。實驗數(shù)據(jù)應用方差分析，家族組與對照組比較ADP表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，家族組與散發(fā)組及散發(fā)組與對照組比較ADP表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組研究對象ADP表達量

2.2 3組研究對象CYP2C19基因表達量

CYP2C19基因在3組的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，家族組中CYP2C19基因表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CYP2C19基因在散發(fā)組與對照組中表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組研究對象cyp2c19基因表達量

2.3 3組研究對象CYP2C19蛋白表達量

CYP2C19蛋白表達量在家族組、散發(fā)組及對照組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 3組研究對象CYP2C19蛋白相對表達量

2.4 3組研究對象P2Y12基因G52T位點多態(tài)性

實時定量PCR技術檢測血小板膜受體P2Y12的基因序列在G52T位點單核苷酸多態(tài)性，基因型分布頻率為家族組GG 22例(88.0%),GT 3例(12.0%),TT 0例(0.0%)；散發(fā)組GG 18例(72.0%),GT 7例(28.0%),TT 0例(0.0%)；對照組GG 14例(56.0%),GT 10例(40.0%),TT 1例(4.00%)。P2Y12 基因的G52T位點在家族組、散發(fā)組和對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 11.261，P=0.024)，GG基因型攜帶者有患腦血栓的高風險。

2.5 3組研究對象GPⅡb/Ⅲa 表達量

用ELASA法檢測GPⅡb/Ⅲa表達量，結果顯示GPⅡb/Ⅲa在家族組高表達，散發(fā)組中表達，對照組低表達，家族組與對照組比較GPⅡb/Ⅲa表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，家族組與散發(fā)組及散發(fā)組與對照組比較GPⅡb/Ⅲa表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 3組研究對象GPⅡb/Ⅲa表達量

2.6 家族組和散發(fā)組入院時NIHSS評分和治療3個月后mRS評分比較

家族組及散發(fā)組入院時NIHSS評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；家族組及散發(fā)組治療3個月后mRS評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 家族組與散發(fā)組NIHSS及mRS評分

家族組及散發(fā)組研究對象P2Y12受體在G52T位點不同基因型分為GG組(GG基因型)和GT組(GT基因型)，行入院NIHSS評分比較，GG組和GT組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),常規(guī)治療3個月后隨訪行mRS評分比較，GG組和GT組mRS評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表8。

表8 GG與GT組NIHSS及mRS評分

3 討 論

LAA腦梗死呈現(xiàn)家族聚集現(xiàn)象，LAA腦梗死先證者一級親屬患病率是對照組患病率的3.14倍,LAA腦梗死家族史是LAA腦梗死發(fā)生的重要危險因素。ADP、CYP2C19、P2Y12及GPⅡb/Ⅲa等基因多態(tài)性與LAA腦梗死療效密切相關[5-6]，但與家族聚集性LAA腦梗死發(fā)病機制及預后研究報道較少。

3.1 ADP與腦血栓發(fā)病機制研究

血小板有3種ADP受體: P2Y12 、P2Y1及P2X1 受體。P2Y12 受體存在于血小板膜上，ADP是促進血小板活化的重要激動劑之一[5]。ADP以較高濃度儲存在血小板致密顆粒中，當血小板受到刺激活化后，ADP 從致密顆粒中釋放出來作用于多種受體，增強自身及其他誘導劑對血小板的誘導作用并促進LAA腦梗死形成。本實驗結果顯示ADP在家族組高表達，說明家族組易導致LAA腦梗死發(fā)生。ADP增高導致家族聚集性LAA腦梗死發(fā)生的可能機制：(1)ADP與血小板表面P2Y12或P2Y1受體結合，進一步激活血小板和加強了活化信號轉導，激活LAA腦梗死形成的最終通路，即GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原配體結合；(2)ADP所引起的血小板聚集與濃度密切相關，低濃度ADP刺激不引發(fā)內源性纖維蛋白原釋放，高濃度ADP才引起其釋放，即使沒有外源性刺激也可以導致或加強血小板聚集。

p450參與臨床70%～80%的藥物代謝一期反應，其中CYP2C19約占20%，其參與許多臨床藥物代謝，如抗血小板前藥氯吡格雷[6]。CYP2C19*2是CYP2C19的主要遺傳缺陷等位基因，在黃種人和白種人中占代謝不良者的75%～85%[7]。研究顯示家族組與散發(fā)組及對照組比較，CYP2C19基因表達量明顯下調，這可能是導致家族聚集性LAA腦梗死發(fā)生或復發(fā)的原因之一，其可能機制為：(1)CYP2C19參與花生四烯酸的肝外代謝對LAA腦梗死形成有影響的環(huán)氧花生酸，其與LAA腦梗死發(fā)病風險有關；(2)CYP2C19弱代謝型個體更易發(fā)生LAA腦梗死，急性LAA腦梗死患者弱代謝型個體更易在急性期病情進展加重[8]；(3)CYP2C19 功能缺失基因型降低了其編碼的酶活性，經(jīng)其代謝的表氧二十碳三烯酸水平隨之降低，表氧二十碳三烯酸具有降血壓、抗炎、抗凝、抗動脈粥樣硬化等作用，從而導致LAA腦梗死發(fā)病風險增加[9]；(4)CYP2C19 G681A的A基因型和A等位基因可能與LAA腦梗死發(fā)生和復發(fā)有關，是LAA腦梗死的獨立危險因素[10]；(5)CYP2C19基因與LAA腦梗死復發(fā)有關。文獻報道急性LAA腦梗死患者76例口服氯吡格雷治療，根據(jù)患者CYP2C19的分型將患者分為3組，結果顯示弱代謝型患者早期病變復發(fā)率明顯高于其他組[11]。CYP2C19失功能等位基因會增加LAA腦梗死復發(fā)風險，其多態(tài)性是不良功能預后的預測因子，但這種作用會隨著時間推移逐漸減弱[12]。CYP2C19基因與LAA腦梗死發(fā)生發(fā)展及療效密切相關[13-14]。

CYP2C19的蛋白表達量在家族組、散發(fā)組和對照組之間無差異，說明CYP2C19對LAA腦梗死形成的影響僅在基因水平發(fā)揮作用，蛋白質水平無影響，其機制不清，可能存在轉錄水平的修飾使得修飾后的基因不再被翻譯，或者CYP2C19基因存在多種突變結構，不排除突變后的基因不再表達相應蛋白質的可能，詳盡機制待進一步研究。

3.2 P2Y12基因G52T位點多態(tài)性與腦血栓發(fā)病機制研究

血小板膜受體P2Y12基因G52T位點多態(tài)性可能影響氯吡格雷療效，但是否影響LAA腦梗死的發(fā)病機制未見報道。研究發(fā)現(xiàn)ADP最主要受體P2Y12基因在G52T位點表達差異，其中GG基因型在家族組的分布頻率最高，散發(fā)組居中，對照組較低，推測GG基因型可能與家族聚集性LAA腦梗死發(fā)病相關，其可能機制是：該基因型的外顯子通過作用于mRNA，改變氨基酸類型，進而影響編碼蛋白功能，影響ADP與受體結合，促進血小板聚集，誘發(fā)LAA腦梗死發(fā)生，其詳盡機制待進一步研究。

3.3 GPⅡb/Ⅲa表達量與腦血栓發(fā)病機制研究

GPⅡb/Ⅲa是由GPⅡb(CD41)和GPⅢa(CD61)兩個亞基借助鈣離子以非共價鍵形式相互連接而成的功能單位。血小板活化的主要標志為GPⅡb/Ⅲa構象改變。GPⅡb/Ⅲa激活是血小板“瀑布式”聚集的最終共同通路和核心環(huán)節(jié)。一旦GPⅡb/Ⅲa出現(xiàn)缺陷，血小板即使被激活，也不能聚集。實驗結果顯示GPⅡb/Ⅲa在家族組高表達，說明家族組易導致LAA腦梗死發(fā)生，其可能機制：(1)高表達的GPⅡb/Ⅲa和纖維蛋白原結合是LAA腦梗死形成的最終通道，血小板變構而富有高度親和力，連接相鄰血小板并與血管性血友病因子相互結合，促進血小板聚集，導致LAA腦梗死發(fā)生；(2)GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性可能影響LAA腦梗死發(fā)生。文獻報道3209例白種人LAA腦梗死患者，GPⅡb基因(ITG2B基因)和GPⅢa基因(ITGA3基因)與LAA腦梗死發(fā)生有關[15]。PLA2基因突變促進GPⅡb/Ⅲa和纖維蛋白原結合，加劇血小板聚集[16]。也有研究報道ITG2B和ITGA3基因與腦梗死發(fā)生無關。目前該受體基因多態(tài)性對LAA腦梗死的影響意見不一，待進一步深入研究。

3.4 家族組與散發(fā)組神經(jīng)功能缺損及預后與遺傳相關性研究

家族組及散發(fā)組入院NIHSS評分差異無統(tǒng)計學意義，說明兩組患者發(fā)病時神經(jīng)功能缺損程度無明顯差異，經(jīng)常規(guī)治療，對兩組患者3月后隨訪mRS評分，兩組患者mRS評分差異有統(tǒng)計學意義，家族組較散發(fā)組差，是否與遺傳因素有關待深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，GG組和GT組入院NIHSS評分及出院3個月后mRS評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義，說明兩組患者神經(jīng)功能缺損程度與P2Y12受體在G52T位點的基因亞型無關，詳盡機制待進一步研究。

LAA腦梗死形成與遺傳及環(huán)境等因素密切相關，多數(shù)LAA腦梗死形成的遺傳方式屬于多基因遺傳，即多個微小效應基因，在多因素作用下產(chǎn)生一個總效應從而導致LAA腦梗死發(fā)生。家族聚集性LAA腦梗死發(fā)生與ADP、CYP2C19、P2Y12及GPⅡb/Ⅲa等基因多態(tài)性相關，其多態(tài)性影響LAA發(fā)生、發(fā)展、治療及預后情況，需進一步深入研究其作用機制，闡明藥物基因組學個體代謝能力差異機制，為腦血管病分層防治提供新的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突