王永迪 邱孟嬌 張曉華 汪 鑫 張志浩 李艷玲 常正堯

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016

纖維素酶(cellulase)最早由Seilliere發(fā)現(xiàn)于蝸牛的消化液中[1]，其主要用途為可以將纖維素降解為葡萄糖，是一種復(fù)合酶[2]。纖維素酶種類(lèi)多，來(lái)源廣，自然界中細(xì)菌、真菌以及大多數(shù)生物體內(nèi)都能產(chǎn)生纖維素酶。在能產(chǎn)纖維素的生物體內(nèi)，真菌纖維素酶的產(chǎn)量高、活性大，因此，真菌成了生產(chǎn)纖維素酶的主要菌種來(lái)源。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[3]，作為重要的中藥材，因其根莖中含丹參酮類(lèi)化合物，常被用于心腦血管疾病的治療[4-5]。除此之外丹參對(duì)于活血、調(diào)經(jīng)、祛瘀、安神、消痛等亦有良好功效[6]，可用于胸肋疼痛、月經(jīng)不調(diào)、斑疹、心悸、失眠等病癥。全國(guó)大部分地區(qū)都有分布，見(jiàn)于荒地、路旁或山坡。在前期工作中，課題組從泰山丹參中分離得到多株能夠產(chǎn)纖維素酶的內(nèi)生真菌，其中篩選發(fā)現(xiàn)了一株產(chǎn)纖維素酶活性高的內(nèi)生真菌菌株LZY9。

響應(yīng)面法(response surface methodology, RSM)是綜合數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)的方法與知識(shí)，將經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c試驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合方程[7]，對(duì)多個(gè)變量進(jìn)行建模和分析[8-9，其所需試驗(yàn)次數(shù)少，周期短，且精密度高，能表示幾種因素間的交互作用的強(qiáng)弱[10-11]。RSM在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，主要用于研究各化學(xué)成分所占比例與生物活性之間的關(guān)系，確定最佳試驗(yàn)條件，現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化[12-15]。本研究旨在對(duì)內(nèi)生真菌LZY9產(chǎn)纖維素酶的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，其研究結(jié)果為纖維素酶的生產(chǎn)提供了一條途徑，也為中草藥地上資源的廢物利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種 丹參內(nèi)生真菌LZY9：由山東第一醫(yī)科大學(xué)李艷玲老師提供。

1.1.2PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖 20.0 g，瓊脂15.0 g，水1000 mL，自然pH值。

1.1.3固體培養(yǎng)基 除特殊說(shuō)明外，本試驗(yàn)所用組成為:取5.0 g經(jīng)過(guò)60目篩的丹參莖葉粉末，加入一定量的去離子水，自然pH值，在121 ℃進(jìn)行滅菌處理30 min，冷卻備用，用于固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn)。本試驗(yàn)所用丹參莖葉粉末來(lái)自萊蕪白花丹參種植基地，經(jīng)自然風(fēng)干、烘干、粉碎、過(guò)篩后，置于干燥器中備用。

1.2 方法

1.2.1丹參內(nèi)生真菌的分離純化 以新鮮健康的丹參為材料，用自來(lái)水清洗樣品的根、莖、葉, 在無(wú)菌條件下，依次以75%乙醇消毒2 min，次氯酸鈉溶液消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗3遍,上述過(guò)程處理完畢后，在無(wú)菌條件下使用剪刀切去其表層組織，將中間部分切成約0.5 cm×0.5 cm大小，用于PDA抗生素(青霉素)培養(yǎng)基的接種，培養(yǎng)室溫度28 ℃，觀(guān)察材料邊緣有菌落長(zhǎng)出。

1.2.2纖維素酶產(chǎn)生菌的初篩 待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落，加入剛果紅溶液(1 mg/mL)使其覆蓋在表面上，10～15 min后，舍去剛果紅溶液，再添加NaCl溶液(1 mol/L)，15 min后倒掉。此時(shí)，在產(chǎn)生纖維素酶的菌落周?chē)霈F(xiàn)有透明圈。

1.2.3真菌LZY9液體發(fā)酵培養(yǎng) 取試管冷凍保藏的菌株，接種至PDA固體培養(yǎng)基，待其復(fù)蘇長(zhǎng)出后，取5 mm的菌餅接種至250 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中裝100 mL PDA液體培養(yǎng)基，搖床28 ℃培養(yǎng)3 d，制備種子液。

1.2.4真菌LZY9固體發(fā)酵 將丹參地上莖葉粉碎，分別過(guò)60目篩，稱(chēng)取5.0 g過(guò)篩藥渣，加入7.5 mL水，封口膜封瓶，浸泡12 h，滅菌。接入20%的菌種LZY9的孢子菌懸液，28 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.5〗粗酶液的制備 將固態(tài)發(fā)酵物放置50 ℃烘干箱烘干1～2 d直至干重，然后用研缽將發(fā)酵物研成粉末。每個(gè)發(fā)酵物粉末稱(chēng)取1 g放入25 mL離心管中，加入25 mL pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液,放入水浴超聲清洗儀中40 ℃超聲提取1 h，提取過(guò)程中每隔15 min震蕩1次，之后采用4層紗布過(guò)濾的方法，以8000 r/min離心10 min。離心后取上清，此上清液即粗酶液。將粗酶液放置冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6CMC酶活力測(cè)定 以0.2 mol/L pH=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液和5%羧甲基纖維素鈉溶液各2.0 mL為底物，粗酶液0.5 mL，依次加入到比色管中，用50 ℃保溫30 min。上述3種液體加入完畢，再加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，進(jìn)行發(fā)色反應(yīng),所得液體經(jīng)冷卻定容后，測(cè)出其吸光度。然后與空白對(duì)照做對(duì)比。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)得還原糖濃度。根據(jù)酶活力大小選出酶活力最大的菌種。

1.2.7固體發(fā)酵條件優(yōu)化 稱(chēng)取5.0 g丹參莖葉粉末，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化LZY9產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件。選取含水量、接菌量、培養(yǎng)天數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，分別編碼(-1，0，+1)，以酶活力為響應(yīng)值，進(jìn)行二次回歸擬合，因素水平見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 Design Expert 8.0.6軟件對(duì)含水量、接菌量、培養(yǎng)天數(shù)3個(gè)因素的響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合分析，采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選培養(yǎng)基染色

利用剛果紅平板篩選法，共從28株丹參內(nèi)生真菌中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶高活性菌株LZY9，見(jiàn)圖1。

圖1 內(nèi)生真菌LZY9產(chǎn)纖維素酶剛果紅平板初篩

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

由Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取含水量、接菌量、培養(yǎng)天數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，以丹參地上莖葉產(chǎn)纖維素酶的酶活力為響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面優(yōu)化得到菌種LZY9固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為含水量5.0%、接種量60%、培養(yǎng)天數(shù)5 d，在此條件下的酶活力為13.417 IU/g。見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與纖維素酶活力

2.3 方差分析

由表3可知，該模型P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9845,校正決定系數(shù)RAdj2=0.9647,失擬項(xiàng)P>0.05，表明該模型回歸有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因而無(wú)失擬因素存在。一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB、AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著,3個(gè)因素對(duì)酶活力的影響作用從大到小依次為：A>B>C。

表3 二次回歸模型方差分析

2.4 響應(yīng)面圖分析

圖2是纖維素酶活力在不同因素相互影響下的響應(yīng)面圖。等高線(xiàn)的不同可以直觀(guān)的反映出不同因素交互作用的影響，若形狀為圓形，則表示因素交互作用不明顯；若形狀為橢圓形，則表示因素間交互作用明顯[19-21]。通過(guò)對(duì)3組圖的比較可得，含水量與接菌量、含水量與培養(yǎng)天數(shù)、接菌量與培養(yǎng)天數(shù)的等高線(xiàn)均為橢圓形，反映出3種因素之間交互作用對(duì)纖維素酶活力影響明顯。三維圖形均為開(kāi)口朝下的凸面，響應(yīng)面中心點(diǎn)位于變量范圍內(nèi)，說(shuō)明纖維素酶活力在兩種因素交互關(guān)系中具有最大值，且隨著因素的改變，纖維素酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

圖2 不同因素組之間交互作用對(duì)纖維素酶活力的影響

3 討 論

本研究從丹參葉中分離到一株產(chǎn)纖維素酶的內(nèi)生真菌菌株LZY9。利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化的方法，優(yōu)化了內(nèi)生真菌LZY9固體發(fā)酵丹參莖葉產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件：在含水量5.0%、接種量60%、培養(yǎng)天數(shù)5 d的條件下產(chǎn)酶量相對(duì)較高。該研究先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，分析得出菌種LZY9固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，方法嚴(yán)謹(jǐn)，真實(shí)可靠。但總體來(lái)看，內(nèi)生真菌LZY9在丹參莖葉上固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力不是特別高，主要原因可能是丹參莖葉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿(mǎn)足內(nèi)生真菌LZY9，因此仍需進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌LZY9固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素的條件。

利用纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖的特性，可以將纖維素酶應(yīng)用于食品、飼料加工、資源再利用等諸多領(lǐng)域[16]。通過(guò)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的工藝條件，能有效提高纖維素酶活力，提高與纖維素酶應(yīng)用有關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率。對(duì)于傳統(tǒng)中藥來(lái)說(shuō)，利用內(nèi)生真菌固體發(fā)酵地上莖葉廢棄物來(lái)生產(chǎn)纖維素酶，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)中草藥資源的再利用，減少中草藥資源浪費(fèi)，也能減少對(duì)環(huán)境的破壞作用，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突