董 曼，王月莉

(銅川市人民醫(yī)院血液科，陜西 銅川 727100)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)為一種造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，病理特征為骨髓造血功能障礙和細(xì)胞增殖異常，在臨床上可表現(xiàn)為貧血、感染、出血等癥狀，隨病情的發(fā)展可進(jìn)展為白血病[1-2]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，臨床上治療骨髓增生異常綜合征的藥物與方法越來越多，包括去甲基化藥物、化療、干細(xì)胞移植等[3]。DNA甲基化異常是MDS發(fā)生的一個(gè)重要分子機(jī)制，地西他濱到達(dá)一定濃度時(shí)可抑制DNA 合成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[4-5]?，F(xiàn)代研究[6-7]表明，小劑量地西他濱可促進(jìn)小鼠白血病細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖，可通過DNA去甲基化機(jī)制在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬形成過程中的重要調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。本研究具體探討不同劑量地西他濱對(duì)MDS小鼠Beclin1表達(dá)的影響，以明確地西他濱的作用劑量與機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)、SPF級(jí)NOD/SCID小鼠36只，雄性，3～4 周齡，18～22 g，購(gòu)于北京維通利華有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2021-007。動(dòng)物合格證號(hào)：32343766。小鼠嚴(yán)格飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣飼養(yǎng)籠具內(nèi)，對(duì)小鼠所有操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，消毒飲用水。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)1周嚴(yán)格檢驗(yàn)檢疫。人骨髓增生異常綜合征SKM-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源庫(kù)。注射用鹽酸地西他濱(國(guó)藥準(zhǔn)字H20040958)購(gòu)自哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)公司(0.2 g/瓶)。BCA法蛋白定量試劑盒等Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司，含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。抗體購(gòu)自武漢三鷹公司。手術(shù)器械均高溫滅菌。動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究。

1.2 MDS小鼠模型制備 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 SKM-1細(xì)胞，制成密度為5×107/ml 的單細(xì)胞懸液，按1×107/ml濃度經(jīng)鼠尾靜脈接種(小鼠接種前2 d腹腔內(nèi)注射抗鼠CD122單抗200 μg)。

1.3 小鼠分組與治療 將MDS小鼠模型分為模型組、低劑量組、高劑量組，每組12只。模型組、低劑量組、高劑量組隔天于腹腔內(nèi)分別注射5 mg/kg生理鹽水、5 mg/kg地西他濱、10 mg/kg地西他濱，治療28 d。

1.4 觀察指標(biāo) ①觀察與記錄小鼠一般狀況并測(cè)定體重；②在治療第14天和第28天測(cè)定小鼠的外周血指標(biāo)，包括紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)等；③取小鼠外周血分離單個(gè)核細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與記錄CD45+細(xì)胞百分比；④在治療第28天處死小鼠，取肝、脾組織研磨后提取蛋白，采用Western blot法檢測(cè)Beclin1蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 見表1。治療后，低劑量組和高劑量組小鼠第14、28天體重都高于模型組(均P<0.05)，但低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表1 三組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較(g)

2.2 三組小鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)RBC、WBC、PLT比較 見表2。治療后，低劑量組和高劑量組治療第14、28天RBC、WBC、PLT高于模型組(均P<0.05)，但低劑量組與高劑量組上述指標(biāo)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 三組小鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)RBC、WBC、PLT比較

2.3 三組小鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)CD45+細(xì)胞比例比較 見表3。治療后，低劑量組和高劑量組第14、28天CD45+細(xì)胞比例低于模型組(均P<0.05)，但低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

2.4 三組小鼠治療后肝、脾組織Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見表4。治療后，低劑量組和高劑量組第28天肝、脾組織Beclin1表達(dá)水平高于模型組(均P<0.05)，但低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表3 三組小鼠治療后不同時(shí)間點(diǎn)CD45+細(xì)胞比例比較(%)

表4 三組小鼠治療后肝、脾組織Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

MDS屬于克隆性血液疾病，為比較常見的血液性惡性腫瘤，起源于惡性造血干/祖細(xì)胞[10-11]。該病患者如果伴有出血、感染等情況，容易出現(xiàn)病死。使用細(xì)胞系構(gòu)建MDS小鼠模型是探索MDS發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等的重要手段，特別是隨著NOD/SCID小鼠的發(fā)展，異種移植出現(xiàn)免疫排斥的概率越來越低[12]。本研究顯示治療后低劑量組和高劑量組小鼠第14、28天體重高于模型組，RBC、WBC、PLT值也高于模型組，但低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從機(jī)制上分析，MDS的發(fā)生、發(fā)展與DNA過度甲基化有關(guān)，胞嘧啶甲基化異常、腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄可造成細(xì)胞異常增生并出現(xiàn)致癌反應(yīng)，為此甲基化療法逐漸得到認(rèn)可[13-14]。低劑量地西他濱可阻滯DNA甲基轉(zhuǎn)移酶并降低DNA甲基化水平，有效減緩耐藥情況，進(jìn)而對(duì)抑癌基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，減少腫瘤細(xì)胞增殖[15-16]。

MDS是一種異質(zhì)性的造血干細(xì)胞疾病，其常見突變主要位于第23號(hào)外顯子第882位氨基酸且突變率為15%左右的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因突變[17]。地西他濱是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可減少DNA甲基化[18]。其可作用于增殖期細(xì)胞，使高甲基化的抑癌基因恢復(fù)為正常的去甲基狀態(tài)，從而發(fā)揮抑癌功能，當(dāng)前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療[19]。本研究顯示，治療后低劑量組和高劑量組第14、28天CD45+細(xì)胞比例低于模型組，但低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明低劑量地西他濱就可抑制MDS小鼠的增殖與浸潤(rùn)。研究[20-21]顯示，低濃度地西他濱具有使DNA甲基化喪失甲基化的作用，可促進(jìn)抑癌基因表達(dá)。

MDS的主要臨床特征為一系或多系血細(xì)胞減少及髓系細(xì)胞發(fā)育異常，也涉及惡性腫瘤的自噬調(diào)控表達(dá)分析[22]。Beclin1基因是重要的誘導(dǎo)自噬因子，主要作用于自噬啟動(dòng)階段，是潛在的腫瘤抑制基因[23]。特別是惡性腫瘤細(xì)胞面臨更高的代謝壓力，為應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏，需要通過抑制Beclin1的表達(dá)來維持其存活。本研究顯示，治療后低劑量組和高劑量組第28天小鼠肝、脾組織Beclin1相對(duì)表達(dá)水平高于模型組，而低劑量組與高劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明低劑量地西他濱就可提高M(jìn)DS小鼠的Beclin1表達(dá)水平。

綜上所述，低劑量地西他濱即可提高M(jìn)DS小鼠的Beclin1表達(dá)水平，抑制增殖與浸潤(rùn)，從而促進(jìn)小鼠外周血與體重恢復(fù)正常。但本研究也存在一定的不足，涉及的劑量組比較少，且沒有進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。