李朝波，翟秀超，溫 琦，王世賓

無錫中糧工程科技有限公司 (無錫 214035)

L-賴氨酸(Lysine)是人體必需的8種氨基酸之一，在8種必需氨基酸中是唯一的僅L-型成分才能有效利用的[1]。L-賴氨酸是構成蛋白質(zhì)的一種必需氨基酸，哺乳動物不能自行合成，且在谷物食品中含量極低，在加工過程中損失嚴重，所以被稱為第一限制性氨基酸。2019年國內(nèi)賴氨酸產(chǎn)能和產(chǎn)量分別達280萬t和197萬t，產(chǎn)品90%用于飼料養(yǎng)殖業(yè)[2]。目前，在L-賴氨酸的生產(chǎn)方法多為微生物發(fā)酵法，比較典型的菌種為大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等[3]。國內(nèi)賴氨酸生產(chǎn)技術已經(jīng)達到國際領先水平，賴氨酸產(chǎn)量居世界第一[4]。

在發(fā)酵過程中，氮源主要用于構成菌體細胞和含氮目的產(chǎn)物，其中無機氮源是微生物生長的速效氮源，而有機氮源為菌體生長提供氮元素和必須的生長因子，對發(fā)酵起著至關重要的調(diào)控作用，可促進生長速率，調(diào)節(jié)初級代謝及次級代謝的通量；控制生長水平，啟動次級代謝產(chǎn)物形成；控制生長速率，影響菌型形成，從而影響發(fā)酵產(chǎn)量；影響供氧水平，增加功率消耗[5]。因此添加不同有機氮源對培養(yǎng)基的優(yōu)化意義重大[6]。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成本直接影響著生產(chǎn)企業(yè)的盈利，如何降低發(fā)酵培養(yǎng)基原料成本，是企業(yè)利潤提高的迫切需求。傳統(tǒng)的L-賴氨酸發(fā)酵過程中，以硫酸銨為無機氮源，玉米漿、豆粕水解液和多肽粉等為有機氮源。本文結合生產(chǎn)實際，擬分別用玉米漿、菌體蛋白水解液[7]、菌體蛋白水解液加玉米漿混合物、豆粕水解液、多肽粉等作為有機氮源，研究不同有機氮源對L-賴氨酸發(fā)酵過程的影響，進而優(yōu)化有機氮源的使用，降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)利潤。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

L-賴氨酸生產(chǎn)菌，Corynebacterium glutamicum JULY1801菌株。

1.1.2原材料

玉米漿、豆粕水解液、多肽粉、菌體蛋白，安徽億輝生物科技有限公司，菌體蛋白水解液，實驗室自制。

1.1.3設備與儀器

5 L發(fā)酵罐；721型分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；M100型生物傳感分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；E-10型銨離子分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；1 000 mL三角燒瓶；恒溫搖床，太倉市強文實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1搖瓶培養(yǎng)

(1)搖瓶培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖110 g/L，氯化鈉2.9 g/L，磷酸二氫鉀5.7 g/L，蛋白胨16 g/L，VB10.005 g/L，丙酮酸鈉0.005 g/L,硫酸銨13 g/L。

按上述配方稱量藥品，將藥品置于燒杯中加水，用氨水調(diào)pH值 7.5，轉(zhuǎn)入1 000 mL三角燒瓶，定容100 mL。裝入滅菌鍋，待溫度升至121 ℃開始計時，溫度控制在121 ℃～123 ℃，維持20 min。

(2)搖瓶種子培養(yǎng)

將接種后的搖瓶在內(nèi)層8層紗布上扎上棉繩后，牛皮紙輕放在搖瓶上，放入搖床培養(yǎng)48 h。搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃，每隔2 h監(jiān)控1次溫度。

1.2.2發(fā)酵罐培養(yǎng)

(1)種子培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖65 g/L，蔗糖24 g/L，磷酸二氫鉀1.2 g/L，蛋白胨12 g/L，VB10.005 g/L，醋酸氨38 g/L，硫酸銨1 g/L。

將培養(yǎng)基溶解后加入錐形瓶，pH用氨水調(diào)節(jié)至6.9，加入泡敵0.5 mL，滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蔗糖10 g/L，玉米漿12 g/L，硫酸鎂9 g/L，氯化鉀5.5 g/L，磷酸6 g/L，硫酸銨20 g/L。

將培養(yǎng)基溶解后加入錐形瓶，氨水調(diào)pH值至6.5，滅菌鍋121 ℃滅菌23 min。

(3)培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：在火焰保護下將一級種子按5%接種量接入5 L種子罐中，初始裝液量3 L。用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0，pH范圍：6.9～7.0 。設置轉(zhuǎn)速恒定700 r/min，風量恒定至1.5 L/min進行培養(yǎng)。若溶氧還不足，再提罐壓至0.06～0.07 MPa。待種子培養(yǎng)液OD562值在1.0左右時，按照10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

發(fā)酵培養(yǎng)：按照10%接種量將種子液接入到5 L的發(fā)酵罐中，初始通氣量為1.0 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min；pH通過流加氨水控制在6.9～7.0；培養(yǎng)溫度37 ℃。當殘?zhí)呛虯N降至一定值時，將葡萄糖和硫酸銨溶液流加到培養(yǎng)基中；并以泡敵消泡防止泡沫外逃。

1.2.3測定方法

菌體含量：以OD值表示，發(fā)酵液稀釋50倍后，用721分光光度計在波長562 nm下測量吸光度；殘?zhí)呛康臏y定：生物傳感分析儀；氨氮含量的測定：銨離子分析儀；L-賴氨酸含量的測定，生物傳感分析儀；溶氧的測定：溶氧電極。

2 結果與討論

2.1 不同有機氮源對 L- 賴氨酸搖瓶發(fā)酵的影響

分別選取玉米漿、豆粕水解液、多肽粉、菌體蛋白水解液以及菌體蛋白水解液和玉米漿混配作為初始有機氮源，添加量為 12 g/L(菌體蛋白水解液和玉米漿混配時各6 g/L)，搖床培養(yǎng)48 h,測定結果見表1。

表1 不同有機氮源對 L- 賴氨酸搖瓶發(fā)酵的影響

通過搖瓶試驗可知，玉米漿、菌體蛋白水解液、玉米漿和菌體蛋白水解液混配物都是良好的發(fā)酵有機氮源。為了進一步確定一種最優(yōu)氮源，現(xiàn)分別用玉米漿、菌體蛋白水解液、玉米漿和菌體蛋白水解液混配物作為有機氮源用5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)。

2.2 不同有機氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵罐發(fā)酵的影響

分別選取玉米漿、菌體蛋白水解液以及菌體蛋白水解液和玉米漿混配作為初始有機氮源，添加量為 12 g/L(菌體蛋白水解液和玉米漿混合時各6 g/L)，發(fā)酵罐培養(yǎng)36 h。

2.2.1不同有機氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵菌體生長的影響

由圖1可以看出，不同有機氮源對L-賴氨酸生產(chǎn)菌的生長影響不大。3種不同有機氮源，在對數(shù)生長期的時間段一致，即均在3 h進入對數(shù)生長期，12 h進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期持續(xù)時間均在15 h左右。以玉米漿和菌體蛋白混配作為有機氮源時菌體對應的最大OD值略大，OD值約在1.04。

圖1 不同有機氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵菌體生長的影響

2.2.2不同有機氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

由圖2可以看出，使用不同有機氮源發(fā)酵，在36 h停止發(fā)酵時，以玉米漿和菌體蛋白水解液1∶1混合的有機氮源的產(chǎn)酸量略大于以玉米漿、菌體蛋白水解液為有機氮源的產(chǎn)酸量。

圖2 不同有機氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

3.2.3不同有機氮源對賴氨酸發(fā)酵綜合指標影響

由表2可以看出，使用不同有機氮源，在36 h停止發(fā)酵時，以玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用的有機氮源的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率最髙，均優(yōu)于以單品種玉米漿或菌體蛋白水解液為有機氮源的發(fā)酵指標。

表2 不同有機氮源對賴氨酸發(fā)酵綜合指標影響

3 結論

影響L-賴氨酸發(fā)酵指標的因素很多，如菌種、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件、發(fā)酵過程控制等。其中有機氮源種類的選擇對菌體生長和 L-賴氨酸的產(chǎn)量影響較大。本試驗根據(jù)表2可以看出，玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用作為L-賴氨酸發(fā)酵的有機氮源有利于產(chǎn)酸和提高轉(zhuǎn)化率。且菌體蛋白是賴氨酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、糖類及維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是利用微生物發(fā)酵氨基酸的優(yōu)質(zhì)原料[8-11]。按年產(chǎn)4萬t 98.5%賴氨酸計算，可回收理論菌體蛋白水解液2 800 t，將菌體蛋白作為有機氮源可以降低賴氨酸生產(chǎn)原料成本，并提高副產(chǎn)物的附加值。

玉米漿是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的，玉米在浸漬過程中，由于使用了一定量和濃度的亞硫酸，使種皮成為半透性膜，一些可溶性蛋白，生長因子、無機鹽和糖類進入到浸漬水中，因而玉米漿含有豐富的營養(yǎng)物，它可按一定比例加入到玉米皮中，以彌補玉米纖維中蛋白質(zhì)含量的不足，可以用于氨基酸的培養(yǎng)基[12]。

本文通過實驗確定了玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用作為 L-賴氨酸發(fā)酵的有機氮源，既能提高產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率，又可在成本方面相對其它有機氮源占有明顯的優(yōu)勢。