陳子凡，董 瑩，何思東，劉 康，吳麗娟，黃 浩

1.河源市食品檢驗所 (河源 517000) 2.黃埔海關技術中心 (廣州 510700) 3.河源市工業(yè)和信息化局 (河源 517000) 4.河源海關 (河源 517000)

藍莓含有兒茶素、綠原酸、花青素等營養(yǎng)物質[1]，具有抗癌、保護心血管、保護肝臟、預防近視等作用[2-4]。從2003年起至今，以藍莓為原輔料登記保健食品有98種，配方中的功效物質均以花青素為主，隨著藍莓花青素的保健功效被群眾所日漸認可，藍莓產品的市場會越來越廣闊[5-6]。本文通過查找和收集國內外相關文獻，對藍莓花青素檢測技術的發(fā)展和現狀進行分析，為藍莓中花青素檢測技術的開發(fā)和制標提供參考。

1 藍莓花青素成分概述

花青素，屬于水溶性植物色素，基本結構為黃鎓鹽陽離子結合物。藍莓主要含有矢車菊素、飛燕草素、錦葵素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素6種[7]，但由于結構不穩(wěn)定，花青素在藍莓中以糖苷類物質存在[8]，這些糖苷類物質通常由花青素和1個或多個葡萄糖、蕓香糖等糖結合而成[9]。

2 檢測技術的研究

藍莓花青素檢測方法主要有pH值示差法、分光法、色譜法、質譜法。其中pH值示差法、分光法只能檢測花青素總含量，色譜法可測定花青素類物質的種類和含量，而質譜法則可以檢測到花青素糖苷的種類和含量。本文也列舉兩種類似藍莓產品檢測花青素的質譜方法作為參考。

2.1 pH值示差法

pH值示差法采用光度計于510 nm和710 nm處檢測吸光值，計算可得花青素的總含量，具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)點。

張榮菲等[10]通過正交試驗，分析了60%乙醇中鹽酸含量、超聲提取時間、料液比和超聲提取水浴溫度，發(fā)現60%的乙醇-0.2%鹽酸溶液對藍莓果實中花青素提取效果影響最大，在該提取條件下使用pH值示差法檢測藍莓果實中的花青素，測得藍莓果實的花青素含量為1.91 mg/g。葉紅玲等[11]通過正交試驗，確定提取藍莓果渣中花青素的最佳工藝條件是選用pH值2.5的70%乙醇水溶液、超聲波功率200 W下每提取2 s停4 s的間歇，料液比(g/mL)1∶30、30 ℃超聲20 min，最終測得果渣的花青素含量為9.99 mg/g。張星[12]等采用1 mL藍莓試供液分別與9 mL pH 1.0的KCl緩沖液和9 mL pH 4.5的NaAc緩沖液混合，靜置15 min后檢測510 nm和700 nm下的吸光度，并以蒸餾水為空白，測得藍莓提取液中花青素含量為160.30 mg/100 g。

2.2 分光法

分光法是在520～540 nm波長之間進行掃描，獲得特征峰，利用標準對照品確定花青素的百分比含量。T/CCCMHPIE 1.25-2016中[13]，稱取15～20 mg越橘提取物樣品用60 mL 2%鹽酸-甲醇溶液在80 ℃水浴中回流水解0.5 h，然后過濾，以2%鹽酸-甲醇作空白，在540 nm吸收波長下對花青素進行檢測。該方法測得花青素含量以飛燕草素計，數值以百分比含量%表示。

曾榮華等[14]參照T/CCCMHPIE 1.25—2016，稱取樣品50 mg，加入30 mL 2%鹽酸甲醇溶液進行超聲提取，冷卻后用2%鹽酸甲醇溶液定容，稀釋后以2%鹽酸甲醇溶液作為空白，在540 nm處測量吸光度，測得藍莓樣液的花青素含量為25.4%。

2.3 色譜法(LC)

LC法是在加溫下將花青素苷類物質轉變成花青素，使用紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測可測得花青素的種類和含量。

NY/T 2640—2014標準，取勻漿后的藍莓樣品1～10 g，用25%鹽酸-乙醇水溶液定容至50 mL，超聲提取30 min后于沸水浴中水解1 h，靜置后取上清液過0.45 μm水相濾膜，使用UV或DAD檢測器檢測，該方法的檢出限在0.15～1.50 mg/kg之間[15]。

T/CCCMHPIE 1.25—2016中[13]，稱取125 mg樣品加入25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇溶液定容，移取溶液用10%磷酸水溶液定容，過0.45 μm濾膜后在高效液相色譜上用外標法定量。

陳海龍等[16]考慮到藍莓花青素常用的萃取液為有毒的甲醇和乙醇，研究使用食用有機酸作為提取溶劑。稱取2 g打漿藍莓，加入30%檸檬酸溶液，超聲30 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm有機膜，利用高效液相色譜法檢測，該方法的精密度RSD為1.36%，最低檢出限為0.06 mg/kg，加標回收率為98.28%。

王歡等[17]通過對檢測波長、水解溫度、水解時間的研究，采用了稱取1～5 g樣品，用鹽酸-乙醇-水(1∶2∶1)提取液定容至25 mL，超聲提取30 min，然后在120 ℃烘箱中水解60 min，再統(tǒng)一采用HPLC在525 nm檢測波長處對6種花青素進行檢測。該方法的花青素回收率在80.50%～108.80%。

王馨悅[18]將樣品粉碎勻漿后，以1∶10的料液比加入52%乙醇，以469 W微波提取4 min，提取液于3 500 r/min離心5 min后取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后制成浸膏備用。檢測時，用純凈水復溶稀釋后過0.45 μm水相濾膜上機測試。該方法的共有峰面積RSD值為1.12%～2.62%，保留時間RSD值為0.14%～0.31%。

Matthew Hynes[19]等使用30 mL的乙腈-0.3%磷酸水溶液(80∶20)作為萃取液，將0.3 g藍莓均質1.5 min，最后以2 500 r/min離心10 min，取2 mL上清液和200 μL濃鹽酸混合，放入具有自封隔膜的玻璃瓶中，渦旋后放入150 ℃的烘箱中水解30 min。30 min后，取出玻璃瓶放入0℃的冰箱中10 min，以停止水解。從冰箱取出樣品后，恢復至室溫，立即過0.45 μm濾膜，上機分析。結果顯示曲線R2值在0.988～0.992之間，6種花青素能在2分鐘能完全出峰。

Pranathi[20]等稱取0.125 g樣品，采用了1 mL的2%甲酸-甲醇溶液作為提取液，旋渦攪拌溶解，再加入4 mL 10%磷酸溶液，分析前，使用0.2 μm醋酸纖維素濾膜過濾樣品。結果顯示曲線R2值在0.999 1～0.999 8之間，檢測低限在0.10～1.56 μg/mL之間。

2.4 質譜法(MS)

采用MS法無需將花青素糖苷水解和提純等前處理，降低了花青素的損失，可以測得花青素苷類物質種類及含量。

韓雪[21]等稱取2 g藍莓果泥，按1∶15(g/mL)加入50%甲醇水，在80 ℃下回流提取1 h，將提取液于8 000 r/min下離心10 min，上清液用0.25 μm濾膜過濾，使用飛行時間質譜儀(TOFMS)分析，在6種藍莓果實中鑒定出13種的花青素糖苷。

島津企業(yè)管理(中國)有限公司-分析中心[22]采用稱取10 g樣品用20 mL 80%甲醇溶液超聲提取15 min、9 000 r/min離心5 min，重復提取2次，合并定容至50 mL，過0.22 μm膜后使用三重四極桿質譜儀(QQQ)檢測花青素苷含量，該方法在0.1～2.0 mg/kg范圍內建立校準曲線，相對標準偏差在0.69%～5.13%之間，花青素苷的最低檢出限量在0.000 3～0.028 9 μg/mL。

張協光[23]等稱取1 g粉碎后的樣品用5%甲酸-甲醇溶液定容，超聲提取30 min，再次定容后離心，過0.22 μm濾膜后上線性離子阱質譜儀(LITMS)檢測，建立了可以同時6種花青素苷和6種花青素的方法，結果表明在0.042 4～19.9 μg/mL范圍內線性良好，回收率為61.9%～112.7%，方法的檢出限在1.73～8.10 ng/mL。

2.5 其它方法

本次研究也發(fā)現類似藍莓的產品采用了一些可供參考的質譜方法，這些方法可以快速檢測花青素苷類物質的含量，前處理更為簡便快捷。

夏碧琪[24]等采用親水作用色譜(HILIC)串聯質譜儀檢測葡萄酒中的4種花青素，葡萄酒試供品用甲醇稀釋1 000倍后，無需其他前處理，過0.22 μm濾膜后，上機分析。該方法的線性范圍在1.0～50.0 ng/mL間，R值高于0.999 2，方法定量限為0.05～1.00 ng/mL。

王海敬[25]等采用甲酸-甲醇(1∶9)溶液為溶劑，加入內標物后進行液液萃取，在4 ℃條件下提取12 h后，4 000 r/min離心取上清液上機，使用四級桿飛行時間質譜(QTOF)對番茄提取物進行檢測，同時檢測12種花青素，在線性范圍在1～1 000 μg/mL，定量限<1 μg/mL。

3 結論與展望

綜上所述，pH值示差法和分光法，主要適用于花青素的總量檢測，廣泛應用于藍莓和藍莓產品的質量鑒別、藍莓花青素含量的快速檢測。液相色譜法可以對藍莓的花青素種類進行定性和定量，有助于分析藍莓產品在花青素的分離提純時效果各種花青素在抗氧化效果方面的所起的作用和原理。質譜儀法則直接檢測藍莓中的花青素的糖苷物質。為選育藍莓品種提供參考，揭示花青素苷在藥品中構效關系及作用機制，以及花青素提取制備過程對天然色素結構特征和功能活性的影響。隨著花青素檢測技術的發(fā)展，建立藍莓及其提取物中花青素和花青素苷的檢測方法和標準，對提高藍莓產品質量、保障消費者購買花青素產品質量、提高食品監(jiān)管部門的檢測能力都有重要意義。