郭亞寧，張盼盼，羅 玉，陳潤峰，張 雄

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 ，陜西 榆林 719000)

NAC是植物特有的較大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其命名起源于NAM、ATAF1/2和CUC1/2三類基因。隨著多種植物的基因組測序完成，為NAC轉(zhuǎn)錄因子在基因組水平的分析奠定基礎(chǔ)，在擬南芥、大豆和玉米中分別鑒定得到117[1]、150[2]和216[3]個(gè)家族成員，同時(shí)在棉花、卷心菜、毛果楊等植物中分別鑒定得到NAC轉(zhuǎn)錄因子，說明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物中具有廣泛的作用[4]。近年大量研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及逆境應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，芒屬中的MlNAC10基因能夠提高擬南芥的抗旱能力[5]；狼尾草中的PgNAC21調(diào)控?cái)M南芥對高鹽的忍耐力[6]；香蕉MpSNAC67基因參與葉綠素合成途徑[7]。綜上可知，NAC蛋白作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長具有普遍的調(diào)控作用。

綠豆(VignaradiataL.)是我國重要的食用豆類[8]，其籽粒富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是高血脂、糖尿病人的優(yōu)良食材[9]。綠豆基因組數(shù)據(jù)的公布[10]，為綠豆的分子相關(guān)研究奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。大量研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，但綠豆中關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究匱乏，綠豆中的功能NAC亟待挖掘。本研究基于綠豆基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法，對綠豆中NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行核酸組成及結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化分析、聚類分析，保守結(jié)構(gòu)域分析，初步鑒定得到綠豆功能NAC基因，為綠豆的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 綠豆中VrNACs的鑒定

基于綠豆基因組數(shù)據(jù)(ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene)，借助NCBI中擬南芥及水稻的NAC蛋白序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過本地Blast軟件進(jìn)行tblastn同源比對，設(shè)置E-value<1E-10，Identity>200，去冗余后，得到完整的CDs共59條，按照順序命名為VrNAC1-VrNAC59，NCBI中對應(yīng)編號見附表1。

1.2 VrNACs的染色體定位及保守結(jié)構(gòu)域多重比對

利用DNAMAN軟件，進(jìn)行VrNACs的核酸分子量、長度及保守序列的多重序列比對分析；利用mapchart軟件對VrNACs的染色體體定位信息進(jìn)行可視化分析。

1.3 VrNACs的模體分析及ka/ks計(jì)算

利用MEME(http://meme-suite.org/)在線分析VrNACs的模體結(jié)構(gòu)；通過KaKs Calculator軟件，分析VrNACs在隨著綠豆進(jìn)化過程中的演替方向。

1.4 VrNACs的聚類分析

基于VrNACs氨基酸序列及擬南芥的137條ANACs，利用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進(jìn)行多重序列比對，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VrNACs的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)分析

VrNACs的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)如表1所示。59條VrNACs基因的核酸長度分布于498～2919 bp之間；59條綠豆VrNACs序列的G/C含量較低，A/T的含量較高。

2.2 綠豆VrNAC序列的多重序列比對

利用DNAMAN軟件，對59條VrNACs序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果見圖1。綠豆的VrNAC序列的N端相對保守，長度在450 bp左右，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可以劃分為A、B、C、D和E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域[11]，其中C亞結(jié)構(gòu)域保守性最高，可能是NAC轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白或下游DNA的結(jié)合的決定因子。綠豆VrNACs序列的C端差異顯著，可能與NAC轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性相關(guān)，綠豆VrNACs基因的結(jié)構(gòu)特征與其他植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征一致。

圖1 159條VrNACs的多重序列比對

2.3 VrNACs的染色體定位

根據(jù)綠豆基因組數(shù)據(jù)，利用mapchat軟件對59個(gè)VrNACs基因的染色體定位進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見2。除VrNAC1-VrNAC6、VrNAC23、VrNAC24、VrNAC28、VrNAC29和VrNAC44分別定位到scaffold_7、43、48、51、86、137、179、312、341和425上，其余48個(gè)基因均準(zhǔn)確定位于綠豆的11條染色體上，其中9號染色體無VrNAC基因分布，4號和10號染色體分別僅包含VrNAC30和VrNAC58，1號、5號和7號染色體的VrNACs基因分布較多，2號和6號染色體上各包含5個(gè)VrNACs基因，3號、8號和11號染色體分別有3個(gè)VrNACs基因分布，該結(jié)果表明VrNACs在綠豆11條染色體非均勻分布。

2.4 VrNACs的模體分析

利用MEME在線軟件分析59條VrNACs的模體組成，結(jié)果見圖3。VrNACs的模體數(shù)量及相對位置存在較大的差異，且VrNACs的6個(gè)模體大部分存在于N端。其中VrNAC07、VrNAC09、VrNAC12、VrNAC53、VrNAC50、VrNAC05和VrNAC20聚類到同一分支，均包含3個(gè)不連續(xù)模體；VrNAC33、VrNAC14、VrNAC44、VrNAC28、VrNAC35、VrNAC04、VrNAC22和VrNAC41均包含5個(gè)不同的模體。

圖2 VrNACs的染色體定位分析

圖3 綠豆VrNACs的模體分析

圖注：Chr1-chr11分別代表綠豆基因組標(biāo)注的1-11號染色體。

2.5 VrNACs的ka/ks分析

通過KaKs_Calculator軟件計(jì)算7對VrNACs基因的ka/ks比值，結(jié)果見表3。7對VrNACs基因的相似性均大于45%，其中VrNAC13-VrNAC52、VrNAC32-VrNAC43、VrNAC08-VrNAC45、VrNAC12-VrNAC53和VrNAC37-VrNAC48的ka/ks比值均大于1，為正選擇過程；VrNAC25-VrNAC55和VrNAC03-VrNAC17均小于1，為純化選擇過程。

表3 VrNACs的ka/ks值

2.6 VrNACs和ANACs的氨基酸序列的聚類分析

利用MEGA軟件對擬南芥和綠豆的NACs序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。196個(gè)NACs共聚為7個(gè)亞類，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ。59個(gè)VrNACs非均勻地分布到7個(gè)亞類中，其中Ⅰ亞類包含7個(gè)VrNACs；亞類Ⅱ包含綠豆VrNAC57和5個(gè)擬南芥的NAC蛋白；第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ亞類亞類分別包含9、8、13、6、15個(gè)綠豆VrNACs。

圖4 59個(gè)VrNACs和137個(gè)ANACs的氨基酸序列聚類分析

3 討論

綠豆中的59個(gè)VrNAC基因N端保守，保守區(qū)域長度約150aa，C端變異較大，表明其N端涉及VrNAC蛋白靶向下游因子的準(zhǔn)確性，C端變異較大說明綠豆VrNACs蛋白在功能上存在顯著性差異；綠豆VrNAC基因集中分布在1、2、5、6、7號染色體上，9號染色體無分布，其余染色體分布較少，同時(shí)位于同一染色體的VrNACs具有相似的模體結(jié)構(gòu)，屬于同一亞類，推測VrNACs在隨著綠豆的進(jìn)化過程中發(fā)生復(fù)制和變異是非均衡的，且同一染色體上的VrNACs通過共同的祖先，經(jīng)過多次復(fù)制、變異產(chǎn)生多個(gè)相似基因[12]。聚類結(jié)果表明綠豆的VrNACs非均勻分布于7個(gè)亞類中，根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的原理，結(jié)合擬南芥中NAC蛋白在植物生長發(fā)育及逆境脅迫中的功能多樣性，推測綠豆的VrNACs可能參與綠豆的生長發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答。