金曉飛,楊郁鵬,趙季宇,曹韻茗,李佳茹,郝重耀

(山西中醫(yī)藥大學第三臨床學院,山西晉中 030619)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA),臨床常被稱膝關(guān)節(jié)炎、膝骨病、膝骨關(guān)節(jié)炎等,中醫(yī)學中也稱作“膝痹”“鶴膝風”,其臨床發(fā)病原因多樣,且病情多嚴重。 因體質(zhì)、耐受等不同,現(xiàn)代醫(yī)學中尚未有一種方法可以準確診斷其分期[1-2],目前該病的臨床診斷多采用DR/CT/MRI 等,這些技術(shù)的使用,為疾病的診斷提供了一定的參考,但對疾病的發(fā)展分期把握尚有不足,醫(yī)者在分期診斷時會存在一定的誤診風險,進而可能會錯失最佳的治療,使得病情延誤。 因此迫切需要一種方法來對膝關(guān)節(jié)炎進行分期的劃分,以便更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 月齡健康清潔級日本大耳白兔40 只,雌雄各半,體重(2.25±0.1) kg,實驗動物由北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供[SCXK(京)2016-0007],中國食品藥品檢定研究院檢測,飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學實驗中心清潔級動物實驗室[SYXK(京)2016-0034]),溫度20℃,濕度50%～55%,單籠飼養(yǎng)50 cm×40 cm×40 cm,標準飼料喂養(yǎng),造模期間兔子自由飲水攝食,動物實驗研究的倫理審批單位為山西中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會(2020DW086),實驗研究過程做到了3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

石膏繃帶(15 cm×460 cm 浙江安吉華埠實業(yè)有限公司);嬰兒秤(上?；ǔ彪娖饔邢薰綞R70型);切片機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司YGQ-III);石蠟包埋機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司YB-6LF);顯微鏡(日本尼康株式會社Nikon H550 L)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組

40 只日本大耳白兔,按照隨機數(shù)字表進行分組為模型 1 組、模型2 組、模型3 組、模型4 組,每組樣本量10 只。

1.3.2 模型制備

改良后的Videman 法左后肢伸直位固定制動法制備KOA 模型[3-4]:造模前動物禁食10 h,采用3%烏拉坦耳緣靜脈麻醉30 mg/kg,剪去左后肢踝關(guān)節(jié)以上兔毛,牽拉踝部使膝關(guān)節(jié)完全伸直位,先用常規(guī)紗布纏繞,外用棉棒輔助(因為兔膝關(guān)節(jié)力量較大,伸直位時用兩側(cè)鈍頭的棉棒行輔助固定,固定膝前后),后用石膏繃帶經(jīng)20℃～30℃熱水浸泡5 ～10 s 軟化后,從腹股溝到趾頭行制動術(shù),已膝關(guān)節(jié)髕骨為中心進行纏繞包裹,足趾不予覆蓋留以觀察血供,石膏硬化后,外層以透明膠紙再次固定,以防脫落。 若繃帶松動或脫落及時重新固定。 如足趾充血嚴重或足趾發(fā)黑,立刻拆除繃帶,待腫退后再行固定。 如膝部撕咬損傷后一律剔除,累積制動分別達 10 d、20 d、30 d、40 d,造模結(jié)束 1 周后進行相關(guān)取材。

在造模期間各組兔子沒有死亡,膝關(guān)節(jié)無腐爛等損傷,造模均達到相應(yīng)的制動周期,數(shù)據(jù)完整,無脫落。

1.3.3 觀察

(1)行為學觀察

分別于造模前1 d 和各組造模結(jié)束后參考改良Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)級別評估量表[5],對各組兔的膝關(guān)節(jié)活動情況、疼痛狀態(tài)、關(guān)節(jié)腫脹程度等進行檢驗,予以評分。

(2)形態(tài)學觀察

各組造模結(jié)束,均予以空氣栓塞法處死動物,打開各組膝關(guān)節(jié), 取膝周組織, 進行JessicaBadendick 大體形態(tài)評分[6],對各組兔的軟骨顏色、關(guān)節(jié)炎范圍大小、軟骨的質(zhì)地和厚度等進行評估。

(3)病理觀察(HE 染色)

取下的軟骨和韌帶,用4%組織固定液固定24 h,后常規(guī)石蠟包埋,5 μm 厚度連續(xù)切片,HE 染色后顯微鏡下觀察,要求觀察位置固定。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料結(jié)果以平均數(shù)±標準差()表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,組內(nèi)比較采用獨立驗本t檢驗。 統(tǒng)計結(jié)果以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)級別評估

在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程中,疾病隨受損傷時間的延長而出現(xiàn)了明顯的階段變化,其大致可分為四個階段,早期、初期、中期、晚期,其中晚期的癥狀最為嚴重。

如圖1 所示隨著造模時間的延長,膝關(guān)節(jié)評分呈現(xiàn)上升趨勢,其中造模1/2/3 組間的差距較為顯著,造模3/4 組間差距較小。 4 組造模后,模型組動物關(guān)節(jié)部位已經(jīng)完全僵化,不可彎曲(I 級0 分,II級 1-4 分,III 級 5-8 分,IV 級 9-11 分)。

隨著造模時間的延長,膝關(guān)節(jié)的評分呈現(xiàn)上升趨勢,其中造模1/2/3 組間的差異較為顯著,造模3/4 組間差距較小。 第4 組造模后,模型組動物關(guān)節(jié)部已經(jīng)完全僵化,不可彎曲。 (Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)評分可分為四級,I 級0 分,II 級1-4 分,III 級5-8 分,IV 級 9-11 分)。 本次實驗結(jié)果可見(圖 1A/1B)。

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié) JessicaBadendick 大體形態(tài)評分

圖2 和圖3 為各組結(jié)束造模之后的各組關(guān)節(jié)評分情況和各組軟組織取材情況,可見各組差異明顯:模型1 組,在軟組織表面出現(xiàn)部分的黃染,光澤減退,組織緊密程度略有改變,但整體致密。 模型2組組織出現(xiàn)了血色分布,且組織顏色進一步加深,黃染嚴重,但仍有光澤尚存,組織的緊密度進一步下降,在組織與關(guān)節(jié)的連接處已經(jīng)出現(xiàn)了少量的粘連。 模型3 組組織的軟組織血色分布已經(jīng)沾滿了組織的1/2 以上,組織顏色暗淡無華,組織的緊密度已經(jīng)出現(xiàn)了部分的降解,關(guān)節(jié)粘連嚴重,軟組織已經(jīng)粘連與關(guān)節(jié)骨面之上。 模型4 組關(guān)節(jié)的軟組織表面已經(jīng)完全布滿血絲,組織變得松軟粘稠,不易取出,軟組織體積已經(jīng)達到了最大,與周圍的關(guān)節(jié)粘嚴重,有的已經(jīng)完全粘連不易松解。

2.3 關(guān)節(jié)病理切片觀察

圖4 為各組髕韌帶HE 染色結(jié)果展示:模型1組,染色整體完整,部分出現(xiàn)脫落,血管翳出現(xiàn)較少,細胞核的排列稍微出現(xiàn)不齊,與空白組相比差距較小。 模型2 組,染色脫落嚴重,血管翳增多,細胞核的排列出現(xiàn)了嚴重的混亂。 模型3 組,染色脫落嚴重,血管翳持續(xù)增加且血管翳混亂,細胞核著色困難,只有少數(shù)可見,排列混亂嚴重。 模型4 組,染色脫落完全,視野中已經(jīng)沒有細胞核可見,血管翳持續(xù)增加,視野中隨處可見。

圖1 各組Lequesne MG 的膝關(guān)節(jié)級別評估Note. As shown in figure1B, there were significant differences in the knee behavior of each model group,P＜0.05.Figure 1 Evaluation of knee joint grade in each group

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)Jessical Badendick 大體形態(tài)評分Note.B,There were significant differences in the gross morphological scores of Jessicabadendick among different tissues of rabbit knee,P＜0.05。Figure 2 Morpjoiogical evaluation of jessicabadendick of knee joint in each group

圖3 空白組與模型各組關(guān)節(jié)軟組織取材Figure 3 The joint soft tissue samples were collected from the blank group and the model group

圖4 空白組與模型各組髕韌帶HE 染色結(jié)果Figure 4 HE Staining results of patellar ligament in blank group and model group

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎,作為一種慢性組織損傷性疾病,西醫(yī)學認為該病的發(fā)生是由于局部的損傷,導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨的病理性退變使得局部的組織分解、粘連所導(dǎo)致。 中醫(yī)把該病歸屬于“痹癥”[7],有記載“風寒濕三氣雜至,合而為痹”,認為該病的發(fā)生是由于多種原因使得膝關(guān)節(jié)局部氣滯血瘀,膝部的經(jīng)脈、經(jīng)筋等組織病變,進而產(chǎn)生萎縮、痙攣從而不能發(fā)揮其正常的生理功能。 目前針對該病的治療方法多樣[8],(1)非藥物療法:如功能鍛煉[9]、物理療法和健康教育等[10]多適用關(guān)節(jié)炎的早期。(2)西醫(yī)療法:非甾體抗炎藥、軟骨保護劑、關(guān)節(jié)腔藥物注射、手術(shù)療法等[11]。 (3)中醫(yī)療法:中醫(yī)方劑、外用貼敷藥、中醫(yī)針灸等[12]。 (4)其他療法:基因療法。 由于膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚未完全清楚,以上的治療方法均為對現(xiàn)存主要癥狀的治療活或改變致病的因素,但疾病的發(fā)展過程中疾病的外在表現(xiàn)往往略遲于病情的發(fā)展。 所以合理把握疾病發(fā)展的內(nèi)在分期,繼而采取相對應(yīng)的治療顯得尤為重要。

本課題組采用石膏制動制備模型,經(jīng)行為學觀察和病理檢測,成功制造了膝關(guān)節(jié)炎模型。 目前,西醫(yī)學中對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎尚未進一步劃分,中醫(yī)學中關(guān)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的分型也尚未有完全統(tǒng)一的認識,其致病因素多為感受風、寒、濕、熱等外在致病因素所致以及內(nèi)在的痰、瘀等病理產(chǎn)物所致,其分型大致分為:氣滯血瘀證、濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證[13],本次實驗是通過石膏制動,使得膝關(guān)節(jié)局部氣血運行受阻,產(chǎn)物代謝失常,膝關(guān)節(jié)充血,最終制造瘀血型膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。 對上述數(shù)組實驗動物的行為學評分和病理檢測進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析,提示組間差距顯著。 因此我們推測膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進程可大致分為初期、早期、中期、晚期四個階段。 且由于外在的石膏制動持續(xù)存在,使得病情的發(fā)展呈持續(xù)加重的趨勢。 在制動的早期階段,關(guān)節(jié)部組織已經(jīng)發(fā)生了損傷,在組織表面的光澤度已經(jīng)下降,血管翳雖然尚未出現(xiàn),但已經(jīng)有部分的黃染,可能是制動使得局部缺氧導(dǎo)致。 中醫(yī)認為該病的初期階段外在或者內(nèi)部的損傷作用,使得膝部的經(jīng)筋、韌帶以及軟骨等組織血供出現(xiàn)障礙,因此組織出現(xiàn)了最初的病變,此時只會表現(xiàn)出局部感覺的略微不適,尚不會對日常的生活生產(chǎn)造成影響,因此最容易被忽視,導(dǎo)致疾病的進一步發(fā)展。 在制動的20 d 左右,膝部關(guān)節(jié)的不適感會增強,實驗中動物表現(xiàn)出撕咬等狀況,且解剖發(fā)現(xiàn)組織的光澤度下降,黃染嚴重,顏色如煙熏,該階段病情呈加重,不適感進一步加強。 在制動的30 d 左右,膝部的不適感持續(xù)增加,解剖可見軟組織黏性增強,出現(xiàn)了部分分解,組織分解粘連在關(guān)節(jié)的活動處,造成了關(guān)節(jié)活動的障礙,外在表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)的屈伸不利,解除制動,關(guān)節(jié)活動也有明顯的障礙,對生活影響較大。 在制動的40 d 左右,膝部關(guān)節(jié)已經(jīng)完全粘連,解除制動屈伸嚴重受限,解剖可見骨關(guān)節(jié)已經(jīng)完全被分解的組織粘連,關(guān)節(jié)腔嚴重狹窄。

該次實驗?zāi)Ｐ偷闹苽渲苽洳捎昧耸嘀苿臃?造模過程中兔左后肢出現(xiàn)了腫脹、充血黑青等外在表現(xiàn),肉眼清晰可見,且通過對患者的解剖學觀察可見膝關(guān)節(jié)腔各組織出現(xiàn)了血管翳的錯雜分布以及黃染,因此可以充分證明該模型可以對應(yīng)臨床的血瘀型關(guān)節(jié)炎。 中醫(yī)學中認為瘀血的出現(xiàn)是多種致病因素作用的結(jié)果,如:氣滯血瘀、痰凝血瘀等?？梢婐鲅嵌喾N疾病后期的必要表現(xiàn),在關(guān)節(jié)炎發(fā)生中瘀血幾乎可以伴隨疾病的發(fā)生全過程,且在治療過程中也常常出現(xiàn)。 所以在關(guān)節(jié)炎的研究中應(yīng)該予以重視。 另外本次實驗中我們對制動造模后的KOA 關(guān)節(jié)炎進行了分期,這可以說是本文的創(chuàng)新點之一,目前尚未發(fā)現(xiàn)此類的研究,本次實驗在中醫(yī)認為的淤血型關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)上,再次結(jié)合西醫(yī)學的病理評分劃分分期,有效結(jié)合了中西醫(yī)學關(guān)于該病的認識,進而把握該型關(guān)節(jié)炎,可能為精準醫(yī)學的發(fā)展提供必要的參考,針對不同的分期采取相應(yīng)的治療也可能更加有利于關(guān)節(jié)炎的治療。

綜上所述,損傷是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生的一種重要原因,在膝關(guān)節(jié)炎的防治中,及早解除外在的損傷性因素可能是最為關(guān)鍵的一環(huán)。 上述實驗可見,關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進程中,會有明顯的幾個階段,可以大致分為初期、早期、中期、晚期。 但是當前的多種技術(shù)如x 線,多通過骨刺的形成來鑒別,我們通過解剖觀察認為骨刺的形成可能是多種病理產(chǎn)物堆積的結(jié)果,多出現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎的后期,骨刺一旦形成,常規(guī)的中藥療法和運動療法療效較差。 因此合理地盡早地把握各個階段的病理特征,對癥治療才能更好地防治病情。 我們希望對關(guān)節(jié)炎模型的合理性分期做一種嘗試并加以論述,為之后的實驗做一定的參考。