亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        Marcksl1 基因敲除小鼠的建立及造血表型初步分析

        2021-06-17 02:07:50高麗娟李爭光史旭東齊曉龍張連峰馬元武
        中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:基因型胚胎干細(xì)胞

        李 博,高麗娟,于 磊,張 旭,李爭光,劉 寧,史旭東,高 凱,李 靜,高 珊,齊曉龍,張連峰,馬元武*

        (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021; 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

        血液是生命的動力源泉,造血伴隨整個生命進程,造血系統(tǒng)發(fā)育包括原始造血和定向造血兩個階段[1]。 胚胎發(fā)育的第7 天(E7 d),小鼠原始造血發(fā)生于卵黃囊的血島,產(chǎn)生原始的有核紅細(xì)胞及髓系祖細(xì)胞。 定向造血最早出現(xiàn)于主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonepluos,AGM)區(qū),在胚胎發(fā)育的E11.5 d 造血干細(xì)胞在 AGM 區(qū)生成[2]。 E12.5 d時,造血干細(xì)胞從AGM 區(qū)通過血液循環(huán)到達小鼠胎肝并迅速增殖。 E15.5 d 時造血干細(xì)胞從胎肝向脾中遷移,同時胎肝中的造血干細(xì)胞逐漸減少[3]。E17.5 d 時造血干細(xì)胞從脾向骨髓中遷移并最終定居于骨髓[4]。 整個胚胎期造血干細(xì)胞的發(fā)生、遷移和成熟涉及多個組織器官,這些組織器官對造血系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要,造血發(fā)育調(diào)控已成為研究者們的探究重點和熱點內(nèi)容。 造血系統(tǒng)發(fā)育是一個精細(xì)且復(fù)雜的調(diào)控過程,涉及一系列的調(diào)控因子包括TGF-β、BMP4、Notch1、RUNX1 和 GATA2 等。 研究表明TGF-β 的表達損傷會影響小鼠卵黃囊的血管生成并導(dǎo)致造血功能缺陷[5-6]。 Dzierzak 和 Speck在2009 年證實RUNX1 和GATA2 調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞向造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程,從而影響造血干祖細(xì)胞的生成以及存活[7-8]。 另外一項研究則表明WNT 通路對AGM 中內(nèi)皮細(xì)胞向造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及造血干細(xì)胞的生成至關(guān)重要[9]。 盡管目前對小鼠造血過程已有較深入的了解,但是由于造血過程的復(fù)雜性,真正了解完整的造血過程仍有很長的路要走。尋找新的造血干細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子,對于進一步了解造血發(fā)育過程和治療血液系統(tǒng)疾病具有重要意義。

        豆蔻?;母缓彼?C 激酶底物蛋白1(Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate like 1,MARCKSL1),屬于 MARCKS 家族成員,又稱為MARCKS 相關(guān)蛋白(MRP),MARCKS 樣蛋白(MLP)和腦蛋白 F52[10]。 MARCKS 家族蛋白包括MARCKS 和MARCKSL1 兩個家族成員,其包含三個保守的功能域: (1) MARCKS 同源結(jié)構(gòu)域 2(MARCKS Homology 2, MH2)域;(2)N 末端結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域可以進行可逆的豆蔻?;?(3)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(effector domain, ED),富含帶正電荷的氨基酸殘基,易于被蛋白激酶C(PKC)或其他蛋白激酶磷酸化[11]。 MARCKSL1 在被蛋白激酶磷酸化后,從細(xì)胞質(zhì)側(cè)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,參與調(diào)控細(xì)胞侵襲和遷移,血管運輸以及各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理活動[12-13]。 已有研究表明,MARCKSL1 在整合素激活、大腦發(fā)育、細(xì)胞粘附調(diào)控、細(xì)胞吞噬、粘蛋白分泌、有絲分裂以及血管生成等活動中發(fā)揮作用[14-16]。 并且,MARCKSL1 缺失會造成小鼠神經(jīng)管閉合缺陷[17]。 目前,尚未發(fā)現(xiàn)Marcksl1 在造血系統(tǒng)發(fā)育中的功能和作用。

        在前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)Marcksl1 基因在造血干細(xì)胞中高表達,并且在老年小鼠的造血干細(xì)胞中表達顯著升高,提示其可能在造血干細(xì)胞發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。 為研究該基因在造血干細(xì)胞中的功能,我們利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立了Marcksl1基因敲除小鼠,并通過對其進行初步分析,發(fā)現(xiàn)該基因缺失造成的小鼠胚胎致死發(fā)生在胚胎發(fā)育后期。 隨后通過對小鼠胚胎期造血干細(xì)胞進行流式分析,發(fā)現(xiàn)Marcksl1 缺失影響造血干細(xì)胞的占比。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物

        本實驗中使用SPF 級,C57BL/6 品系小鼠,均為 2 ~3 月齡,體重為 20 ~30 g,雌雄各 10 只。C57BL/6 小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2020-0004],飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所SPF 級動物房[SYXK(京)2019-0011],同時動物飼養(yǎng)間采用12 h 交替明暗照明,動物自由飲水進食。 實驗過程中嚴(yán)格遵循了3R 原則,且涉及的動物相關(guān)實驗均得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用及管理委員會(IACUC)的批準(zhǔn)(ILAS-MYW20005)。

        1.2 主要試劑與儀器

        單鏈DNA 片段(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司);DNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司); 瓊脂糖粉( Biowest Agarose 公司);MEGAshortscript T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1354,Ambion,美國);Lin 流式抗體(BD,美國);Sca1(BD,美國);c-kit(BD,美國);流式細(xì)胞儀(BD,美國);高速離心機(Eppendrof,德國);PCR 擴增儀(Bio-Rad,美國);PCR 儀 (伯 樂, 美 國); Micro-PET/CT 掃 描 儀(Inveon,Siemens,Berlin,德國);數(shù)碼凝膠成像處理系統(tǒng)(天能,中國);全血分析儀(Siemens,德國)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 制備Marcksl1 基因敲除小鼠

        利用本實驗室建立的CRISPR/Cas9 基因編輯平臺,建立Marcksl1 基因敲除小鼠。 針對Marcksl1基因我們設(shè)計了兩個 sgRNA 靶點(靶點 1:GGTGATGTTGGATGGGAGTGAGG: 靶 點 2: GGG AAGAACTTAAACCAACCAGG)。 通過將寡核苷酸片段 M- Marcksl1-E2A-gRNAup: TAGGTGATGTT GGATGGGAGTG 和 M- Marcksl1-E2A-gRNAdown:AAACCACTCCCATCCAACATCA; M-Marcksl1-E2B-gRNAup: TAGGGAAGAACTTAAACCAACC 和 MMarcksl1-E2B-gRNA down: AAACGGTTGGTTTAAGT TCTTC 分別退火后連接到PUC57-gRNA 載體中,構(gòu)建sgRNA 表達載體,利用試劑盒MEGAshortscript T7進行體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA。 利用PMSG 和HCG 超排3~4 周齡的C57BL/6 小鼠后,與成年的雄性小鼠交配,次日從輸卵管中獲得受精卵。 利用顯微注射儀通過將 sgRNA (10 ng/μL),Cas9 蛋白(30 ng/μL)共同注射到小鼠受精卵內(nèi),隨后將受精卵移植到假孕母鼠中,等待小鼠出生后進行基因型鑒定,確定靶基因是否實現(xiàn)敲除。

        1.3.2 胚胎組織的取材

        將Marcksl1 敲除雜合子2 月齡雌鼠與2 月齡雄鼠于前一天進行合籠,并于次日早晨進行陰道栓檢查,如能夠檢測到陰道栓當(dāng)天標(biāo)記胚胎為E0.5 d。懷孕母鼠于E15.5 d 或者E17.5 d 時處死,解剖獲得E15.5 d 及E17.5 d 的胚胎。 分離小鼠胚胎進行稱重并記錄,剪取少量胚胎組織用于基因型鑒定,隨后將胎肝從胚胎中小心剝離,并去除多余組織稱重記錄,用于后續(xù)實驗。

        1.3.3 小鼠基因組DNA 提取

        將E15.5 d 小鼠或E17.5 d 小鼠胚胎組織置于1.5 mL EP 管中并加入120 μL 鼠尾裂解液,經(jīng)過55- 60℃ 孵育過夜,裂解過后按照基因組提取試劑盒說明提取基因組DNA,提取的基因組DNA 溶于0.1× TE 中,用于后期基因型鑒定。

        1.3.4 小鼠的基因型鑒定

        對獲得的胎鼠進行基因型鑒定,用M-Marcksl1-WT-F/M-Marcksl1-WT-R 引物鑒定野生型條帶,片段大小 1923 bp。 用 M-Marcksl1-KO-F/M-Marcksl1-KO-R 引物鑒定敲除條帶,片段大小為316 bp。 PCR反應(yīng)條件: 95℃ 預(yù)變性5 min;95℃變性 30 s,62℃退火 30 s,72℃ 延伸 30 s,29 個循環(huán)。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后,用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳并成像。 引物序列見表1。 將得到的電泳結(jié)果進行分析,只有野生型條帶的為野生型小鼠,只有敲除條帶的為敲除純合子小鼠,兩者都有的為雜合子小鼠,統(tǒng)計分析小鼠基因型。

        1.3.4 血常規(guī)

        將E15.5 d 胚胎經(jīng)斷頭取外周血收集于冷PBS中,采用全自動血液分析儀對胚胎外周血進行血液組分分析。

        1.3.5 胎肝細(xì)胞流式分析

        將分離獲得的小鼠胎肝置于1 mL PBS 溶液中,用1 mL 注射器反復(fù)輕輕的抽吸吹打3~4 次進行單細(xì)胞化,隨后按照表2 中的流式組合進行染色,流式上機進行分析。

        1.3.6 小鼠胚胎CT 掃描

        將查栓獲得的小鼠胚胎整體固定于4%多聚甲醛中,固定完成后使用 Micro-CT 掃描儀(Inveon,Siemens,Berlin,德國)對小鼠全身進行掃描分析。CT 掃描參數(shù)設(shè)定為:電壓:60 kV,電流:400 μA,分辨率為20 μm。 掃描結(jié)束后使用Inveon 分析工作站進行CT 圖像重建及數(shù)據(jù)分析,計算股骨長度進行統(tǒng)計。

        表1 Marcksl1 基因敲除小鼠基因型鑒定引物Table 1 Primers used in this study for Marcksl1 gene knockout mice genotype

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        本文中基因型占比采用卡方檢驗分析,其余所涉及數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,使用Graphpad prism7 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,并且兩組間比較采用 Student’st-tests。 當(dāng)P<0.05 時,則表示差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

        表2 流式流式組合Table 2 The antibody combination used for flow cytometry

        2 結(jié)果

        2.1 建立Marcksl1 基因敲除小鼠

        為研究Marcksl1 在造血系統(tǒng)中的作用,我們利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立Marcksl1 基因敲除小鼠,構(gòu)建策略如圖1A 所示。 對獲得的F0 代小鼠進行基因型分析,其中2 只(2/5)為基因敲除小鼠,敲除效率為40%。 隨后我們對#2 小鼠進行傳代基因型和測序分析,結(jié)果顯示敲除片段能夠有效的傳遞給子代小鼠(圖1B),并對傳代小鼠基因敲除片段測序分析,敲除測序圖譜如圖1C 所示,通過與參考序列比對分析,結(jié)果顯示敲除片段大小為1500 bp 圖1D 所示。 綜上,我們成功在小鼠基因組中敲除了Marcksl1 基因的第二外顯子,并能穩(wěn)定傳代。

        2.2 Marcksl1 基因缺失導(dǎo)致小鼠胚胎致死

        圖1 建立Marcksl1 基因敲除小鼠Note. A, Schematic overview of CRISPR/Cas9 system mediated Marcksl1 gene knockout in mice, targeting site1 and site2 are the sgRNA target sites. B, Germline transmission of Marcksl1 gene knockout mice (#2). (All the F1 mice produced from founder #2 were heterozygous.M, Marker, DL2000. 1-6, Founder #2, and F1 generation number #1-#5. Wild type brand was 1923 bp and the knockout brand was 316 bp); C. The chromatographs from sequences of truncated PCR products; D, The sequences results of truncated PCR products. The deleted DNA fragments of Marcksl1 were shown.Figure 1 Establishment of Marcksl1 knockout mice

        在Marcksl1 基因敲除小鼠繁殖過程中,未獲得純合敲除小鼠,通過對胚胎期小鼠基因型檢測,發(fā)現(xiàn)該基因缺失會造成小鼠顱骨發(fā)育缺陷,導(dǎo)致小鼠胚胎致死(圖2A),這與之前的報道一致[18]。 隨后我們分析了E15.5 d 和E17.5 d 的小鼠胚胎,統(tǒng)計Marcksl1 基因敲除小鼠的占比。 對59 只胎鼠的基因型分析,發(fā)現(xiàn)E17.5 d 純合子小鼠的占比顯著低于E15.5 d 純合子的比例,敲除小鼠在E15.5 d 時占比40%,而在 E17.5 d 時比例不足10%(表3)。對E15.5 d 和E17.5 基因型占比進行卡方檢驗分析(χ2 值為 28.225,P 值為 7.432×10-7),發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學(xué)差異,表明Marcksl1 基因缺失造成的死亡發(fā)生在胚胎發(fā)育后期。 隨后對胚胎E17.5 d 小鼠進行CT 掃描分析,發(fā)現(xiàn)Marcksl1 基因敲除會導(dǎo)致小鼠骨骼發(fā)育異常(圖2B)。 通過對小鼠的股骨長度進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示敲除小鼠的股骨長度與野生型相比較短(圖2C)。

        2.3 Marcksl1 基因缺失不影響胚胎血細(xì)胞數(shù)量和比例

        前期工作中,通過RNA-seq 數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)該基因在小鼠的造血干細(xì)胞中高表達,并在老年小鼠中表達顯著升高,為研究該基因在造血干細(xì)胞中的作用,我們分析了基因敲除后胎肝的發(fā)育情況。 通過對E15.5 d 小鼠胎肝稱重,發(fā)現(xiàn)Marcksl1 敲除小鼠胎肝重(圖3A)以及肝重體重比(圖3B)與野生組相比無明顯差異。 同時我們對E15.5 d 小鼠的外周血進行血常規(guī)分析(圖3C),結(jié)果顯示敲除小鼠組的紅細(xì)胞,白細(xì)胞與血小板的占比與野生組相比無明顯差異。

        2.4 Marcksl1 敲除促進胎肝中造血干細(xì)胞增殖

        為了研究Marcksl1 的缺失對造血干細(xì)胞的影響。 我們通過流式細(xì)胞術(shù)對E15.5d 的小鼠進行胎肝KSL 細(xì)胞(Lin-/Sac1+/c-Kit+cell)占比分析,結(jié)果顯示Marcksl1 基因敲除小鼠胎肝中的造血干細(xì)胞顯著高于對照組中(圖4A,4B),進一步對造血干細(xì)胞進行分類發(fā)現(xiàn)與野生組相比敲除小鼠的長期造血干細(xì)胞(Long-term hematopoietic stem cell, LT)占比較高(圖4C, 4D)。 這些結(jié)果表明Marcksl1 缺失能夠?qū)е略煅杉?xì)胞數(shù)量增加。

        3 討論

        MARCKSL1 在多種組織中表達[11],參與整聯(lián)蛋白活化,細(xì)胞粘附,細(xì)胞遷移,吞噬作用,血管生成和腦發(fā)育的調(diào)控[12,19-21]。 MARCKSL1 最初被發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中高表達,且調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。MARCKSL1 能夠被PKC 磷酸化,結(jié)合肌動蛋白影響胞質(zhì)移位, 進而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬[22]。MARCKSL1 還在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,包括促進炎癥細(xì)胞的遷移以及細(xì)胞因子的分泌。前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)Marcksl1 基因在造血干細(xì)胞中高表達,并且在老年小鼠的造血干細(xì)胞表達顯著升高,提示MARCKSL1 可能在造血干細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用,但是關(guān)于MARCKSL1 在造血系統(tǒng)中的功能仍不清楚。 本研究中,通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立了該基因的敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)敲除Marcksl1 基因?qū)е碌乃劳霭l(fā)生于胚胎發(fā)育后期。 隨后,取胚胎小鼠的外周血進行血常規(guī)檢測,結(jié)果顯示與對照組相比,Marcksl1 基因敲除小鼠的白細(xì)胞,紅細(xì)胞以及血小板的數(shù)量沒有明顯的變化。 并且通過流式細(xì)胞術(shù)對E15.5 d 胚胎小鼠的胎肝細(xì)胞進行染色分析,表明MARCKSL1 缺失導(dǎo)致胎肝中造血干細(xì)胞數(shù)量增多。

        表3 E15.5 d 以及E17.5 d 中不同基因型胚胎的數(shù)量以及占總胚胎數(shù)的比例Table 3 The number and percentage of different genotypes in total E15.5 and E17.5 embryo

        圖2 Marcksl1 基因缺失對小鼠發(fā)育的影響(n≥5)Note. A, The picture of E15.5 WT and Marcksl1-knockout mouse. B, The skull images of WT and Marcksl1 gene knockout mice scanned by CT. C, The femur length of WT and Marcksl1 gene knockout mice scanned by CT. Compared with wild type, *P<0.05, **P<0.01.Figure 2 The function of Marcksl1 gene deletion on mouse development

        圖3 Marcksl1 基因敲除小鼠肝發(fā)育和血細(xì)胞占比分析(n≥5)Note. A, The weight of E15.5 fetal liver. B, Quantitative analysis of the radio of liver weight to body weight. C, The results of E15.5 Peripheral blood routine (WBC, White blood cells, RBC, Red blood cells, PLT, Platelets). ns, Not significant.Figure 3 Analysis the liver development and blood cell ratio in Marcksl1 gene knockout mice

        MARCKSL1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)膜上,通過與PIP2 作用,可以控制 PIP2 的水解,PIP2 被 PLC(phospholipase C)選擇性水解,產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3) 和 DAG (diacylglycerol), 也可以被 PI3K(phosphoinositide 3-kinase) 磷 酸 化, 生 成 PIP3(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate)。 因此,MARCKSL1 的磷酸化狀態(tài)影響了細(xì)胞信號通路效應(yīng)因子,包括磷脂酶D (PLD)和磷酸肌醇激酶3(PI3K),后者通過 PIP2 磷酸化到 PIP3 激活 AKT信號從而調(diào)控下游信號分子[23]。 Liang 等[24]發(fā)現(xiàn)MARCKSL1 通過調(diào)節(jié)AKT / SNAI2 通路促進肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖, 遷移和侵襲。 此外,MARCKSL1 在PI3K/AKT 等信號通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用,并在肝癌、乳腺癌,肺癌中高表達,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及遷移。 免疫系統(tǒng)調(diào)控與造血系統(tǒng)密不可分,造血干細(xì)胞功能的變化直接影響免疫應(yīng)答過程。 本研究通過建立Marcksl1 基因敲除小鼠,初步證明了該基因缺失會影響造血干細(xì)胞數(shù)量,但是Marcksl1 如何調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞發(fā)育和造血穩(wěn)態(tài)平衡仍需進一步研究。 通過本研究,我們成功建立了Marcksl1 基因敲除小鼠,為研究MARCKSL1 在造血干細(xì)胞和胚胎發(fā)育的功能提供了動物模型支持。

        圖4 Marcksl1 基因敲除對胎肝中造血干細(xì)胞的影響(n≥5)Note. A, Analysis of the E15.5 fetal liver KSL cell by flow cytometry analysis. B, The proportion of KSL cell in E15.5 fetal liver. C, The flow cytometry result of LT(long-term hematopoietic stem cells), ST(short-term hematopoietic stem cells), and MPP(multipotent progenitor cells) from E15.5 fetal live. D, The proportion of LT, ST, and MPP in E15.5 fetal liver. Compared with wild type,*P<0.05, **P<0.01.Figure 4 Effect of Marcksl1 gene knockout on hematopoietic stem cell

        猜你喜歡
        基因型胚胎干細(xì)胞
        干細(xì)胞:“小細(xì)胞”造就“大健康”
        母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
        造血干細(xì)胞移植與捐獻
        母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
        干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的春天來了?
        DiI 在已固定人胚胎周圍神經(jīng)的示蹤研究
        西安地區(qū)育齡婦女MTHFRC677T基因型分布研究
        冷凍胚胎真的可以繼承嗎?
        干細(xì)胞治療有待規(guī)范
        BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鑒定
        国产精品国语对白露脸在线播放| 91精品国产92久久久| 伊人大杳焦在线| 99久久久无码国产精品试看| 国产亚洲AV无码一区二区二三区| 亚洲中文有码一区二区| 男女主共患难日久生情的古言| 亚洲精品久久区二区三区蜜桃臀| 伊人久久综合精品无码av专区| 少妇的诱惑免费在线观看| 国产一区二区三区再现| 亚洲youwu永久无码精品| 国产精选污视频在线观看| 思思99热| 日本女优免费一区二区三区| 波多野结衣中文字幕一区二区三区| 久久av高潮av无码av喷吹| 亚洲阿v天堂2018在线观看| 国产一区二区白浆在线观看| 乱子轮熟睡1区| 成人免费网站视频www| 国产裸体AV久无码无遮挡| 99精品国产综合久久麻豆| 成人毛片av免费| 人妻少妇偷人精品无码| 一本色道久久88综合| 美腿丝袜诱惑一区二区| 精品国模一区二区三区| 日韩亚洲中文图片小说| 操国产丝袜露脸在线播放| 日韩夜夜高潮夜夜爽无码| 成年女人毛片免费视频| 自拍视频国产在线观看| 久久一区二区三区久久久| 国产午夜鲁丝片av无码| 无码国产精品一区二区免费网曝| 国产精品自拍网站在线| 久久久久88色偷偷| 亚洲 都市 校园 激情 另类| 精品粉嫩国产一区二区三区| 狠狠综合久久av一区二区蜜桃|