李子潔,劉婷婷,趙學(xué)慶,鄭文榮,王宇峰,田 欣,祝自新,孫芳玲*,王 文*

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州遵義 563006;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物室,北京市老年病醫(yī)療研究中心,北京 100053)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性炎性疾病。 由血小板聚集和血栓形成引起不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊破裂,血管狹窄或閉塞可導(dǎo)致急性心血管疾病[1]。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化病典型表現(xiàn)為動脈最內(nèi)層內(nèi)膜的不對稱局灶性增厚,伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, EC)的血流介導(dǎo)的炎癥變化。 發(fā)病時許多免疫細(xì)胞表現(xiàn)出激活的跡象,并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[2]。 因此,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1 和 MMP-9 等相關(guān)炎癥因子以改善心血管疾病,從而減少動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥,可能為AS 的治療提供新的思路[3-4]。 腦栓通膠囊有活血化瘀,祛風(fēng)化痰的臨床應(yīng)用,可用于治療動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死,但機(jī)制尚不清楚[5]。 本研究采用 ApoE-/-(apolipoprotein E)動脈粥樣硬化小鼠模型[6],探討腦栓通膠囊對AS 小鼠炎癥相關(guān)因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1 和 MMP-9 表達(dá)的影響,旨在為腦栓通膠囊治療AS 的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

33 只SPF 級8 周齡雄性健康A(chǔ)poE-/-小鼠 (品系: C57BL/6J),體重(24±2) g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部)提供[SCXK(京) 2016-0010]。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物室全封閉SPF 級動物房[SYXK (京) 2015-0016],室溫(23±2)℃,空氣相對濕度55%±5%,每日光照12 h。 所有動物實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動物福利3R 原則,經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審核并批準(zhǔn)(XW20170703)。

1.2 主要試劑與儀器

腦栓通膠囊(廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字Z20040093);飽和油紅O 染色液(G1260,北京 索 萊 寶 科 技 有 限 公 司 ); 電 泳 儀(BioRad043BR1549,美國BIORAD 公司);化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(FlourChem HD2,美國Alpha 公司);IL-1β 抗體(ab205924,美國 abcam 公司);MMP-9 抗體(13667T,美國 cell signaling 公司);ICAM-1 抗體(ab179707, 美 國 abcam 公 司); TNF-α 抗 體(ab6671,美國 abcam 公司)、IL-6 抗體(ab6672,美國 abcam 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥

8 周齡雄性ApoE-/-基因敲除小鼠,給予高脂飲食喂養(yǎng)(含0.15%膽固醇、21%脂肪),建立動脈粥樣硬化模型[7-8],高脂飼料喂養(yǎng)12 周后,將小鼠隨機(jī)分為三組,每組11 只:模型對照組、腦栓通小劑量給藥組和腦栓通大劑量給藥組。 模型對照組灌胃給予等體積雙蒸水,腦栓通小劑量給藥組灌胃給藥(0.5 g/(kg·d)),腦栓通大劑量給藥組灌胃給藥(1 g/(kg·d))。 連續(xù)給藥 12 周,每天給藥 1 次。

1.3.2 整體主動脈油紅O 大體染色

喂養(yǎng)時隨機(jī)抽取小鼠,進(jìn)行油紅O 染色,觀察有無斑塊形成,判斷ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展情況并確定模型是否穩(wěn)定。 用1%戊巴比妥鈉麻醉后,充分暴露腹腔、胸腔,用眼科器械仔細(xì)分離心臟周圍組織,剪斷氣管、食管,剪掉肺;從近心端主動脈根部和遠(yuǎn)心端髂動脈剪取整體主動脈。 在體式顯微鏡下,剝離干凈整體主動脈上的脂肪組織和結(jié)締組織。 生理鹽水充分漂洗后,沿著上升主動脈外緣、主動脈弓外緣剪至下降主動脈上端,再沿著上升主動脈內(nèi)緣、主動脈弓內(nèi)緣至髖動脈剪開整體主動脈。 生理鹽水充分洗滌。 60%異丙醇浸洗后用油紅O 染色工作液染色30 min[9]。 在體式顯微鏡下拍照。

1.3.3 Western blot 方法檢測整體主動脈炎癥因子表達(dá)

將整體主動脈在冷的生理鹽水中于體式顯微鏡下將脂肪組織和結(jié)締組織剝離干凈置入離心管中勻漿、超聲。 4℃,4000 r/min 離心 20 min,取上清進(jìn)行BCA 法測定蛋白濃度,通過SDS-PAGE 垂直電泳,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜,根據(jù)蛋白分子量確定電轉(zhuǎn)時間。 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h。 并按說明書的稀釋比例以及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1 和 MMP-9 一抗抗體濃度,并與β-肌動蛋白(β-actin)4℃孵育過夜;1×TBST 漂洗,10 min×3 次,置于搖床上充分漂洗;加入用1×TBST 稀釋的二抗,室溫孵育2 h;洗膜后用ECL 發(fā)光液顯色,于化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光拍照。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入AIC.AlphaView 軟件中進(jìn)行分析,分別計算出目標(biāo)蛋白條帶灰度值,與β-actin 的比值作為蛋白水平的定量指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 用單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA) 進(jìn)行組間樣本均數(shù)比較,P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦栓通對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響

油紅O 染色檢測整體主動脈動脈粥樣硬化斑塊形成情況。 結(jié)果顯示:與模型對照組相比,腦栓通小劑量給藥組動脈粥樣硬斑塊面積有減少趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異(n=8,P＞0.05);腦栓通大劑量給藥組動脈粥樣硬化斑塊面積明顯減少(n=8,**P＜0.01,圖1)。

2.2 腦栓通對 ApoE-/-小鼠主動脈 IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)的影響

腦栓通對小鼠主動脈相關(guān)炎癥因子的檢測結(jié)果表明,與模型對照組相比,腦栓通膠囊小劑量和大劑量給藥組IL-1β 和IL-6 表達(dá)水平明顯降低(n=3,*P＜0.05);大劑量給藥組 TNF-α 蛋白表達(dá)水平明顯減少,而小劑量給藥組無明顯差異(n=3,**P＜0.01,圖 2)。

2.3 腦栓通對ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)皮ICAM-1表達(dá)的影響

與模型對照組比較,腦栓通膠囊小劑量給藥組與模型對照組相比雖有下降趨勢,但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異差異(n=3,P＞0.05);腦栓通膠囊大劑量給藥組與模型對照組相比ICAM-1 的表達(dá)量明顯降低(n=3,*P＜0.05,圖 3)。

2.4 腦栓通對ApoE-/-小鼠主動脈MMP-9 表達(dá)的影響

與模型對照組比較,腦栓通膠囊小劑量給藥組和腦栓通膠囊大劑量給藥組的主動脈MMP-9 表達(dá)水平有所降低,但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異,其中,腦栓通膠囊小劑量給藥組和大劑量給藥組之間也沒有明顯差異(n=3,P＞0.05,圖4)。

3 討論

AS 是動脈壁內(nèi)的炎性疾病,可引起冠狀動脈疾病,心肌梗塞,中風(fēng)和外周動脈疾病。 由于大多數(shù)人生活飲食的不規(guī)律,動脈粥樣硬化在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率正逐年上升,并有年輕化的趨勢[10]。 以前動脈粥樣硬化僅僅被認(rèn)為是動脈壁脂肪沉積引起的管道阻塞。 如今,有部分學(xué)者認(rèn)為動脈粥樣硬化的發(fā)生包括死細(xì)胞和低密度脂蛋白的氧化促炎和免疫刺激特性,以及各種細(xì)胞參與者之間不斷相互作用的結(jié)果[11-12]。 活躍的炎癥過程可能會觸發(fā)斑塊破裂并增加冠狀動脈血栓形成的風(fēng)險,從而導(dǎo)致血管或局部組織缺血[13-14]。 因此,炎癥反應(yīng)可能是造成小鼠動脈粥樣硬化病變的重要機(jī)制。

圖1 各組ApoE-/-小鼠整體主動脈油紅O 染色Note. A, Model-control group. B, Naoshuantong-Low. C,Naoshuantong-High. Compared to the model group, **P＜0.01.Figure 1 Oil red O staining of the whole aorta of ApoE-/-mice in each group

腦栓通膠囊是一種由蒲黃、赤芍、郁金、漏蘆、天麻組成的中藥制劑,主要用于缺血性腦卒中、腦梗塞等病癥[15]。 其療效顯著且穩(wěn)定,但作用機(jī)制尚不清楚。 ApoE 基因編碼的蛋白于1985 年第一次測得,分子量大小為34×103,位于19 號染色體上[16]。它通過結(jié)合低密度脂蛋白受體(LDLR)和乳糜微粒殘基受體來調(diào)節(jié)脂蛋白清除[17]。 因此缺乏ApoE 預(yù)計會導(dǎo)致血漿中富含膽固醇的殘留物的積累,這些殘留物的循環(huán)延長可能引起動脈粥樣硬化。 1992年,有研究報道構(gòu)建了ApoE 基因敲除小鼠。 并在喂食普通飼料的條件下,都出現(xiàn)了血膽固醇高的情況,不需要對照組比較,就可以證明大部分模型在冠狀動脈和肺動脈根部近主動脈處有明顯病變[18-19]。 目前國內(nèi)外在ApoE-/-小鼠AS 后炎癥反應(yīng)的研究甚多,但關(guān)于腦栓通治療AS 的作用效果還未見報道。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),腦栓通能降低ApoE-/-小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol, HDL-C) 水平[7]。 本研究進(jìn)一步通過對ApoE-/-小鼠斑塊面積以及炎癥相關(guān)因子表達(dá)的檢測,深入探討腦栓通膠囊治療動脈粥樣硬化的機(jī)制。 在動脈粥樣硬化慢性炎癥反應(yīng)過程中,IL-1β是心血管疾病的重要調(diào)節(jié)因子,主要由活化的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生,導(dǎo)致IL-6 和c反應(yīng)蛋白水平升高,使血管壁內(nèi)早期沉積的膽固醇結(jié)晶與巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞相互作用,引發(fā)脂肪紋并促進(jìn)局部動脈粥樣硬化生成[14,20-21]。 同樣,TNF-α也可介導(dǎo)全身的炎癥和免疫反應(yīng),其主要由活化的單核巨噬細(xì)胞分秘,參與脂質(zhì)浸潤過程,誘發(fā)病變與斑塊形成。 本研究提示腦栓通膠囊能夠顯著降低 ApoE-/-小鼠主動脈 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)水平,減少脂質(zhì)在內(nèi)皮損傷部位的沉積,抑制動脈粥樣硬化的形成。 細(xì)胞間黏附因子ICAM 屬于免疫球蛋白超家族的糖蛋白,被認(rèn)為是細(xì)胞聚集到炎癥區(qū)的重要黏附因子,在穩(wěn)定細(xì)胞間相互作用和促進(jìn)白血球和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移起到重要作用[22]。 本研究顯示,與模型組相比,ApoE-/-小鼠給與大劑量腦栓通后,能顯著降低ICAM-1 的表達(dá),提示大劑量腦栓通能夠減少巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,減少炎癥因子引發(fā)的后續(xù)炎癥反應(yīng),從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[23]。 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)屬于水解酶家族,能夠降解胞外基質(zhì),比如:彈性蛋白、蛋白多糖和膠原蛋白,參與血管彈性和修復(fù)。 MMP-9 過量表達(dá)可能破壞內(nèi)皮細(xì)胞周圍的基底膜,促進(jìn)單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞間的遷移,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定[24]。ApoE-/-基因敲除小鼠在動脈粥樣硬化模型后,連續(xù)給予腦栓通12 周,小劑量和大劑量給藥組與模型組相比,MMP-9 蛋白表達(dá)量雖有減少趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異。 我們推測這與MMP-9 參與血管生理和病理機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。 MMP-9 蛋白除參與炎性反應(yīng),還在血管修復(fù)中起關(guān)鍵作用[25]。 研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過分泌MMP-9,促血管內(nèi)皮生長因子表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)血管修復(fù)。 同時,血管生成因子又能反饋調(diào)節(jié)MMP-9 的表達(dá),促進(jìn)血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[26-27]。 因此,腦栓通作為有效的腦血管病治療藥物,對MMP-9 的活性調(diào)節(jié)可能不局限于炎癥反應(yīng),后續(xù)將從多個角度觀察其對血管功能的調(diào)控作用。

圖2 腦栓通對 ApoE-/-小鼠主動脈IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平的影響Note. A, Model-control group. B, Naoshuantong-Low. C, Naoshuantong-High. Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 Effect of Naoshuantong on expression of IL-1β、IL-6、TNF-α protein in aorta of ApoE-/- mice

圖3 腦栓通對ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)皮ICAM-1 蛋白的表達(dá)Note. A, Model-control group. B, Naoshuantong-Low. C, Naoshuantong-High. Compared with the model group, *P＜0.05.Figure 3 Effect of Naoshuantong on ICAM-1 protein expression in aortic endothelium of ApoE-/-mice

圖4 腦栓通對ApoE-/-小鼠主動脈MMP-9 蛋白的表達(dá)Note. A, Model-control group. B, Naoshuantong-Low. C,Naoshuantong-High. Compared wsith the model group, P＞0.05.Figure 4 Effect of Naoshuantong on MMP-9 protein expression in aortic endothelium of ApoE-/-mice

綜上所述,ApoE-/-基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化模型在給予腦栓通治療后,可減少主動脈斑塊面積,抑制動脈粥樣硬化的形成,其作用機(jī)制可能與降低炎癥相關(guān)因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 ICAM-1 的表達(dá)有關(guān)。