張京京,童 玲,陸佳涵,盧秋翰,叢 喆,薛 婧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京 100021)

聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法( combination antiretroviral therapy, cART)可以有效地抑制HIV復(fù)制并緩解患者的疾病進程,但由于病毒長期潛伏使HIV 治愈成為難題[1]。 病毒潛伏庫是造成停藥后病毒快速反彈的重要原因之一,它是含有可復(fù)制的完整的HIV 前病毒DNA 但轉(zhuǎn)錄并不活躍的細胞和組織。 潛伏庫細胞以靜息CD4+T 細胞為主[2],近年來國內(nèi)外有多篇關(guān)于潛伏庫細胞標(biāo)志物的研究報道[3-6],CD32 能否作為HIV 潛伏庫的標(biāo)記物成為國際上備受關(guān)注的熱點之一。

CD32(FcγRII)是一種以低親和力與IgG Fc 段相結(jié)合的免疫球蛋白Fc 受體,其主要表達于中性粒細胞、單核細胞、血小板和內(nèi)皮細胞表面[7],分為CD32a ( FcγRIIa), CD32b ( FcγRIIb) 和 CD32c(FcγRIIc)三個亞型[8]。 CD32 參與了巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子[9]。 研究發(fā)現(xiàn)CD32在HIV 感染的靜息CD4+T 細胞上高表達,含有前病毒DNA 的CD32a+CD4+T 細胞占潛伏庫細胞的26.8%至 83.3%[10],并且 CD32+CD4+T 細胞與PBMC 中的前病毒DNA 水平成正相關(guān)[11]。 但也有研究證明CD32 與多種活化標(biāo)志物共表達,可能并不是潛伏庫的標(biāo)志物[12]。 CD32 與HLA-DR 共表達可高達79.2%[13],CD32+靜息CD4+T 細胞中含有的前病毒DNA 與潛伏庫細胞的比值小于3%[14]。由此,CD32 能否作為病毒潛伏庫的標(biāo)志物是值得商榷的,它能否成為治愈艾滋病的關(guān)鍵靶標(biāo)也有待深入探究。

本研究中,利用建立的模擬HIV 患者全病程的艾滋病潛伏感染恒河猴模型,研究感染前與cART不同的治療階段中CD32 在CD4+T 細胞各亞群中的表達量變化,從而初步探索CD32 與潛伏庫的關(guān)系及其在艾滋病疾病進程中發(fā)揮的作用及功能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗選用4 只SPF 級恒河猴,1 只雌性,3 只雄性,購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK(京)2015-0011],年齡為 3 ～4 歲,體重約 4 kg。 實驗前采用免疫熒光法進行篩查,排除猴單純皰疹病毒I型(BV),猴逆轉(zhuǎn)錄病毒(SRV),猴免疫缺陷病毒(SIV)及猴T 細胞白血病病毒(STLV)。 實驗動物飼養(yǎng)及動物實驗研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所審批通過(IACUCXJ19005)。 實驗動物飼養(yǎng)及實驗操作在生物安全三級實驗室進行[SYXK(京)2017-0027],所有動物實驗遵循3R原則。

1.1.2 毒株

實 驗 毒 株 為 SIVmac239。 由 美 國 Aaron Diamond 艾滋病研究中心的Preston Marx 博士惠贈,經(jīng)實驗室使用CEMx174 細胞株擴增制備,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為3×105/mL。

1.2 主要試劑

APC mouse anti-NHP CD45(貨號:561290)、PerCP mouse anti-human CD3(貨號:552851)、PE mouse anti-human CD8(貨號:555367)、BD FACSTM lysing solution(貨號:9224600)、BD TrucountTM tubes(貨號:19276)購自美國BD Pharmingen 公司;FITC anti-human CD4 (貨 號: 317408)、 APC/Cy7 antihuman CD25(貨號:302614)、Brilliant Violet 421 anti-human CD69(貨號:310930)、Brilliant Violet 605 anti-human HLA-DR(貨號:307640)、Brilliant Violet 650 anti-human CD197(CCR7,貨號:353234)、APC mouse anti-human CD45RA (貨 號: 561210)、 PE mouse anti-human CD32 (貨 號: 550586)、 BV786 mouse anti-human CD3(貨號:563918) 購自美國Biolegend 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗樣本收集與處理

分別于感染前(第0 天),攻毒后(第525 天),治療中(第637 天),停藥后(第700 天)采集猴外周血,用于全血流式CD4+T 淋巴細胞計數(shù)分析,血漿病毒載量監(jiān)測,及外周血單核細胞(PBMC)分離純化。

1.3.2 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型建立

將本實驗室保藏的SIVmac239 毒株從液氮罐取出,于 37℃水浴融化,用 RPMI 1640 稀釋至 500 TCID50/mL,靜脈途徑感染恒河猴,建立SIVmac239感染恒河猴模型。 從病毒接種后的第525 天至第672 天感染猴接受cART,治療方案為拉米夫定片30 mg/kg、富馬酸替諾福韋二吡呋酯片20 mg/kg、克立芝20 mg/kg。 上述藥物研磨后分別溶于0.5 mL 三蒸水中混勻,再與等體積的30%環(huán)糊精混勻過濾,放置-20℃保存,治療期間拉米夫定、富馬酸替諾福韋二吡呋酯每日肌肉注射給藥一次,克立芝每日肌肉注射給藥兩次[15],由此建立艾滋病潛伏感染恒河猴模型。 實驗期間,若實驗動物體重低于25%即為仁慈終點,由獸醫(yī)執(zhí)行安樂死,尸體按醫(yī)療垃圾做無害化處理。

1.3.3 血漿病毒載量監(jiān)測

利用QIAGEN 公司的 Viral RNA Mini Kit 試劑盒從實驗猴血漿中提取病毒RNA,使用熒光定量PCR 方法對血漿病毒載量進行定量分析[16]。

1.3.4 外周血中CD4+T 細胞絕對數(shù)及CD4/CD8比值的監(jiān)測

將50 μL 外周血置于流式管內(nèi),加入 APCCD45, PerCP-CD3,FITC-CD4,PE-CD8 熒光抗體孵育30 min,然后裂解紅細胞,使用TrucountTM tubes進行細胞計數(shù),應(yīng)用C6 流式細胞儀上機檢測[17]。

1.3.5 靜息CD4+T 細胞群及細胞亞群中CD32 表達量測定

2×106個 PBMC 中加入 BV786-CD3,FITC-CD4,APC-CD45RA, BV650-CCR7, APC/Cy7-CD25,BV421-CD69,PE-CD32,BV605-HLA-DR 熒光抗體孵育30 min,固定后24 h 內(nèi)使用BD FACS ArialⅡ流式細胞儀上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Flowjo 10 軟件對多色流式細胞儀進行結(jié)果分析,Graphpad 8.0 軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,P＜0.05,具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型中血漿病毒載量、CD4+T 細胞計數(shù),CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化

SIVmac239 靜脈感染的恒河猴(cART-1, cART-2, cART-3, cART-4)建立穩(wěn)定的慢性感染后,經(jīng)cART 連續(xù)治療5 個月,血漿病毒載量在治療期間被完全抑制,由(5.04±0.51) log10copies/mL 至給藥后第3 周全部降低達檢測線2.00 log10copies/mL;停藥后第686～714 天觀察到血漿病毒載量反彈為(5.18±0.77) log10copies/mL(圖 1A)。 感染猴在慢性感染期,外周血CD4+T 細胞絕對數(shù)處于較低水平每毫升(529±102)個(圖1B),且CD4+/CD8+比值出現(xiàn)倒置現(xiàn)象(圖1C);cART 治療期間,CD4+T 細胞絕對數(shù)增加至每毫升(1525±611)個(圖 1B),CD4+/CD8+比值升高至正常范圍并維持在(1.30±0.48)(圖1C),完成了部分免疫重建;停藥后,隨著病毒載量的反彈,CD4+T 細胞再次受到攻擊,CD4+T 細胞絕對數(shù)降低,CD4+/CD8+比值再次出現(xiàn)倒置(圖1B、1C)。

2.2 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型不同階段CD32 在靜息型、活化型或總CD4+T 細胞中的表達變化

從恒河猴外周血中分離得到PBMC 并進行流式分析,根據(jù)CD32 同型對照確定CD4+T 細胞亞群中CD32+的表達量(圖2A)。 與第0 天處于未感染狀態(tài)相比,恒河猴在SIVmac239 感染后CD32+CD4+T 細胞亞群在總CD4+T 細胞中的比例顯著升高,由未感染時的(1.53±0.58)%分別上升至治療前(3.90±1.30)%、治療中(4.56±1.58)%和治療后(5.04±2.36)%(圖 2B)。 進而,將 CD4+T 細胞分為靜息CD4+T 細胞亞群(CD25-CD69-HLA-DR-)及活化CD4+T 細胞亞群。 研究發(fā)現(xiàn),恒河猴處于未感染狀態(tài)時,CD32+CD4+T 細胞亞群在靜息CD4+T 細胞中的比例低至(1.01±0.66)%,且在感染后的不同階段雖略有升高但無顯著差別(治療前(2.28±1.37)%、治療中(3.53±2.08)%、治療后(3.04±1.17)% vs 未感染(1.01±0.66)%;P＞0.05)(圖2C)。 CD32+CD4+T 細胞亞群在活化 CD4+T 細胞中的比例較高((4.10±1.63)%),且在感染后治療前(18.93±4.50)% vs (4.10±1.63)%、治療中(32.05±14.17)% vs (4.10±1.63)%、治療后(26.42±17.58)% vs (4.10±1.63)%三個階段均具有顯著性差異(P＜0.01)(圖2D)。

2.3 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型不同階段CD32 在不同活化標(biāo)記物CD4+T 細胞亞群的表達變化

活化型CD4+T 細胞又可細分為早期活化型(CD69+)、中間活化型(CD69+HLA-DR+)和晚期活化型(HLA-DR+)CD4+T 細胞。 根據(jù) SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型未感染、治療前、治療中及治療后四個階段的研究發(fā)現(xiàn),同未感染狀態(tài)相比,CD32在治療前CD69+CD4+早期活化型T 細胞的比例顯著增加((10.79±3.76)% vs (2.91±0.75)%),CD32 在治療前((37.78±12.28)% vs (10.66±1.47)%)及治療中((49.53±19.30)% vs (10.66±1.47)%)HLA-DR+CD4+晚期活化型T 細胞的比例顯著增加(P＜0.05,圖 3A、3B)。 圖 3C 為 CD32 在四個階段的早期、中間和晚期活化型CD4+T 細胞的表達變化,結(jié)果顯示早期活化型CD32+CD4+T 細胞的比例在感染后持續(xù)下降,晚期活化型CD32+CD4+T 細胞比例逐漸上升,中間活化型CD32+CD4+T 細胞的比例基本維持不變。

2.4 SIVmac239 感染前后CD32 在靜息型或活化型記憶性CD4+T 細胞亞群中的表達變化

接下來,我們比較了病毒感染前后,即未感染組(第0 天取樣)和感染組(第525 天取樣),CD32分別在靜息或活化狀態(tài)下中心記憶T 細胞(TCM)、幼稚 T 細胞(T naive)、效應(yīng)記憶 T 細胞(TEM)、終末分化T 細胞(TEMRA)等各記憶性T 細胞亞群的表達變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),在靜息記憶性CD4+T 細胞亞群中,恒河猴在 SIVmac239 感染后,CD32 在靜息TCM((0.74±0.57)% vs (0.47±0.44)%)、靜息TEM((1.89±1.11)% vs (0.46±0.15)%)、靜息Tnaive((0.17 ± 0.13)% vs (0.07 ± 0.07)%)、TEMRA((0.36±0.34)% vs (0.09±0.07)%)各記憶性T 細胞亞群均無顯著性差異(P＞0.05,圖4A)。在活化的記憶性 CD4+T 細胞亞群中,CD32 在SIVmac239 感染后的活化型 Tnaive ((12.33 ±2.13)% vs (2.41 ± 0.72)%) 和 活 化 型 TEMRA((2.85±1.35)% vs (0.64±0.56)%)兩個記憶性CD4+T 細胞亞群中的比例顯著增加,但在活化型TCM((2.37±1.87)% vs (0.89±0.75%))和活化型TEM((1.33±1.09)% vs (0.37±0.31)%)兩個亞群的比例無顯著性差異(P＞0.05,圖4B)。

3 討論

圖1 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型血漿病毒載量、CD4+ T 細胞計數(shù)、CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化Note. A, Dynamics of viral loads in SIVmac239-infected rhesus macaques with cART. B, Dynamics of viral loads and CD4+ T lymphocyte counts in SIVmac239-infected rhesus macaques with cART. C, Dynamics of viral loads and CD4+/CD8+ ratios in SIVmac239-infected rhesus macaques with cART.Figure 1 Dynamics of viral loads, CD4+ T lymphocyte counts and CD4+/CD8+ ratios in SIVmac239-infected rhesus macaques with cART

恒河猴感染SIVmac239 后,血漿病毒載量長期維持在較高水平,出現(xiàn)CD4/CD8 比值倒置、CD4+T細胞耗竭等現(xiàn)象;處于穩(wěn)定慢性感染的恒河猴在cART 的治療下,血漿病毒載量被完全抑制在檢測線以下,CD4+T 細胞計數(shù)和CD4/CD8 比值逐漸恢復(fù);但一經(jīng)停藥后,病毒載量在一周內(nèi)出現(xiàn)反彈,再次呈現(xiàn)病毒血癥。 由此, 本研究成功建立了SIVmac239 潛伏感染的恒河猴模型,實現(xiàn)了cART治療有效地控制了病毒復(fù)制,并在停藥后出現(xiàn)病毒反彈情況,這都與臨床上艾滋病患者表現(xiàn)出的全病程類似[18]。

鑒于有文獻報道CD32 在HIV 感染的靜息CD4+T 細胞上高表達,被認為是可能的潛伏庫標(biāo)記物之一[10]。 本研究選取SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型的未感染、治療前、治療中、治療后的四個階段,利用PBMC 分析在cART 抑制病毒復(fù)制的治療期間,CD32能否在靜息型CD4+T 細胞、尤其是靜息型CD4+TCM細胞上高表達。 我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒河猴在感染后CD32 在靜息狀態(tài)的CD4+T 細胞中比例并未出現(xiàn)增加,卻在活化狀態(tài)的CD4+T 細胞中顯著升高。 而且,CD32 的表達變化在cART 治療的不同階段沒有顯著性差異,提示CD32 的表達與cART 對病毒復(fù)制的抑制沒有直接關(guān)系。 進而,通過我們對CD32 在早期活化型(CD69+)、中間活化型(CD69+HLA-DR+)和晚期活化型(HLA-DR+)CD4+T 細胞中的表達分析,發(fā)現(xiàn)晚期活化型CD4+T 細胞中CD32 表達顯著增加,提示了HLA-DR+CD4+T 細胞是促成SIV 感染后CD32 表達上升的主要細胞亞群,推測CD32 可能是T 細胞晚期激活的標(biāo)志之一,這與CD32,CD38,Ki67 等活化標(biāo)志物共表達的結(jié)果相一致[14]。

圖2 SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型各階段CD32 在CD4+T 細胞亞群在的比例變化Note. A, Gating of CD32+CD4+ T cell subsets by flow cytometry. B, The percentage of CD32 expression in CD4+ T cells at the indicated stage of monkey model. Compared with uninfected group,the percentage of CD32 expression in CD4+ T cells in pre-treatment group, mid-treatment group and post-treatment group are significantly increased, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. C, Percentage of CD32 expression in resting CD4+ T cells (CD45+ CD3+ CD4+ HLA-DR- CD69- CD25-) at the indicated stage of monkey model. D,Percentage of CD32 expression in activated CD4+ T cells at the indicated stage of monkey model. Compared with uninfected group, the percentage of CD32 expression in activated CD4+ T cells in pre-treatment group, mid-treatment group and post-treatment group are significantly increased. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 Percentage of CD32 expression in CD4+ T-cell subsets at the indicated stage of monkey model

靜息型CD4+T 細胞被認為是主要的HIV 細胞潛伏庫[19],其中以靜息型TCM 細胞更為重要[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CD32 在靜息或活化狀態(tài)的CD4+TCM 細胞中均未有顯著增加,而在活化型的CD4+Tnaive 細胞中比例上升,提示了CD32 可能與Tnaive細胞的免疫活化相關(guān)。 由于Tnaive 有干細胞的特性,具有高度分化能力[21],可以分化為TCM、TEM、Tfh、Th1、Th2 等細胞亞群,因此 CD32 在 SIV 感染后表達升高可能有助于促進Tnaive 細胞分化成其他免疫相關(guān)細胞。

圖3 CD32 在SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型各階段處于不同活化狀態(tài)的CD4+ T 細胞中的比例變化Note, A,The percentage of CD32 expression in CD69+CD4+ T cells at the indicated stages. Compared with uninfected group, the percentage of CD32 expression in CD69+CD4+ T cells in pre-treatment group are significantly increased, *P ＜0.05. B, The percentage of CD32 expression in HLA-DR+CD4+ T cells at the indicated stages. Compared with uninfected group, the percentage of CD32 expression in HLADR+CD4+ T cells in pre-treatment group and mid-treatment group are significantly increased, *P＜0.05. C, The percentage of CD69+,CD69+HLA-DR+, and HLA-DR+ in CD32+CD4+ T cells at the indicated stages.Figure 3 Percentage of CD32 expression in CD69+, CD69+HLA-DR+, and HLA-DR+activated T-cell subsets at the indicated stages

圖4 CD32 在SIVmac239 感染前后記憶性CD4+ T 細胞亞群中的比例變化Note. A, The percentage of CD32 expression in resting TCM, Tnaive, TEM, and TEMRA at the pre- and post-infection stage. B, The percentage of CD32 expression in activated TCM,Tnaive,TEM,and TEMRA at the pre-and post-infection stage. Compared with uninfected group,the percentage of CD32 expression in activated Tnaive and TEMRA are significantly increased after infection, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Percentage of CD32 expression in resting or activated memory CD4+ T cells at the pre- and post-infection stage

綜上所述,我們的研究表明在SIVmac239 潛伏感染恒河猴模型中,CD32 與晚期活化型CD4+T 細胞和活化的Tnaive 細胞相關(guān),與靜息型CD4+T 細胞、靜息型CD4+TCM 細胞無關(guān)。 這些為CD32 不是艾滋病潛伏庫標(biāo)記物這一觀點提供數(shù)據(jù)支持,并為后續(xù)艾滋病治愈研究提供信息。